Бациллу туберкулёза — возбудителя чахотки, буквально косившей население Европы и России почти до середины ХХ века, впервые обнаружил немецкий врач и микробиолог Роберт Кох.

Роберт Кох в своей лаборатории в Берлине, куда он перебрался в 1880 году, получив должность правительственного советника в Имперском отделении здравоохранения.

Предложенная Робертом Кохом твёрдая питательная среда для разведения бактерий произвела настоящую революцию в микробиологии. Теперь микробиологи используют широкий ассортимент твёрдых питательных сред для работы с различными бактериальными культурами.

Для размножения нуклеиновых кислот исследователи из Института белка РАН использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Обычно ПЦР осуществляют в жидкой среде.

Палочки Коха

Роберт Кох в школе был первым учеником, мечтал сделаться морским врачом и объездить весь мир. Поступив в Геттингенский университет, он сначала учился на естественном факультете, но бедно жившие родители уговорили сына перейти на «хлебный» медицинский факультет. Они с нетерпением ждали, когда он станет врачом и начнёт хорошо зарабатывать.

Увы, даже с дипломом доктора найти «хлебное» место оказалось непросто. В 1872 году Кох становится санитарным врачом («физикусом») в городке Вольштейн (ныне это Польша). Его работа сводилась к выдаче свидетельств о болезни, он устанавливал развитие эпидемий, делал прививки, вскрывал трупы. Но, несмотря на занятость, Роберт Кох создаёт домашнюю лабораторию и начинает заниматься научной работой.

Вместо газа для подогрева препаратов он использовал керосиновую лампу. Из тарелок, наполненных мокрым песком, соорудил нечто вроде прибора для разведения микробов. На этот песок он капал кровь заражённого животного и наблюдал за ростом бактериальной культуры. Следил с помощью микроскопа, который он за счёт строжайшей экономии средств купил себе ко дню рождения — на двадцативосьмилетие. С этим скромным инструментарием «отец бактериологии» сделал ряд открытий, поразивших буквально весь мир.

Венцом научной карьеры учёного следует считать разгадку тайн туберкулёза. В те времена считалось, что от этой болезни гибнет седьмая часть человечества. Ныне полагают, что микобактериями туберкулёза инфицирована примерно треть населения Земли.

В XIX веке туберкулёз звали «бугорчаткой». У заражённых этой болезнью людей и животных находили в поражённом органе бугорки. Они состояли из распада живой ткани, гноя. В них-то, видимо, и сидели микробы, обнаружить которые никак не удавалось. За это дело взялся Кох, получивший к тому времени уже немалую известность, перебравшийся в Берлин, где у него была собственная хорошо оборудованная лаборатория, из которой он не выходил с утра до поздней ночи. Вырезал кусочки заражённых органов умерших от туберкулёза людей и тщательно их исследовал.

Понадобились годы упорного труда, чтобы воочию показать миру микробы бугорчатки. Это не были толстые, большие, хорошо видимые палочки до того изученной Кохом сибирской язвы. Это были едва различимые даже под хорошим микроскопом тонюсенькие чёрточки, которые окрестили «палочками Коха».

24 марта 1882 года Роберт Кох делает в Берлинском физиологическом обществе обессмертивший его доклад «Об этиологии туберкулёза». Его выступление имело громадный резонанс. Пожалуй, трудно найти в истории медицины другое сообщение, столь же горячо принятое всей мировой общественностью. И неудивительно, что в 1905 году именно эти исследования Коха были отмечены Нобелевской премией.

Революция в бактериологии

Чтобы исследовать существа-невидимки (микробы), необходимо суметь разглядеть их. Также надо добиться, чтобы это была нужная бактерия, а не случайно подвернувшаяся под руку.

До Коха бактерий разводили в жидких питательных средах, главным образом в бульоне. Понятно, что, когда их помещали в эти жидкие среды, не было гарантии, что тут же рядом не вырастут и посторонние микробы. Приходилось — и не раз! — повторять и повторять одни и те же операции, чтобы добраться до нужных бактерий. Из того места, где они концентрировались больше всего, брали маленькую капельку, переносили её в другую пробирку с бульоном и там выращивали эту колонию. К сожалению, оказывалось, что и здесь присутствовали посторонние микробы, хотя и в меньшем количестве. Опять брали капельку исследуемых микроорганизмов, переносили в третью пробирку — и так до тех пор, пока наконец не получалась более или менее чистая культура, свободная от посторонних примесей.

Однажды Кох случайно заметил, что сваренный картофель, разрезанный пополам, после долгого лежания на лабораторном столе покрылся разноцветными точками: зелёными, коричневыми, красными. Учёный заинтересовался увиденным. Снял платиновой иглой маленькие кусочки с этих разноцветных точек и стал рассматривать под микроскопом. Оказалось, что каждая точка была колонией бактерий, разросшейся на поверхности картофеля. Разных бактерий! Кох мгновенно понял, какое величайшее открытие сделал. Он нашёл твёрдую питательную среду!

Введение Кохом твёрдых питательных сред было революцией в бактериологической технике. В 1881 году он публикует работу «Методы изучения патогенных организмов», в которой описывает способы выращивания микробов на твёрдых питательных средах. С их помощью учёному удалось, используя подходящие красители (фуксин, анилиновые краски), обнаружить в растёртой туберкулёзной ткани больного крохотные, слегка изогнутые, ярко-синие окрашенные палочки, известные теперь как палочки Коха.

Бактериальные (а также вирусные) колонии выращивают теперь не только в жидкой, но и на твёрдой питательной среде, приготовленной на агаре или желатине. Каждая колония представляет собой потомство единственной бактериальной клетки, локализующееся в том месте, где эта родительская клетка была «посеяна». Метод Коха позволяет идентифицировать возбудителя инфекции по виду и свойствам образуемых колоний, а также даёт возможность прямо подсчитывать их число. Всё это делает микробиологический анализ проще, быстрее и дешевле, а результат точнее. При достаточном разведении посевного материала колонии оказываются пространственно разделёнными. И отдельные клетки не мешают друг другу размножаться. Поэтому удаётся определять нужную бактерию даже при исследовании сложных смесей микроорганизмов, в которых искомый инфекционный агент присутствует в следовых количествах или является неконкурентоспособным по отношению к другим быстрорастущим видам микробов.

Метод молекулярных колоний

Роберт Кох показал пример, достойный всяческих подражаний. Этим путём в конце уже ХХ века пошли и российские (тогда советские) учёные, сотрудники Института белка Российской академии наук (ИБ РАН) в городе Пущине на Оке, расположенном примерно в ста километрах от Москвы.

В 1985 году в ИБ РАН была создана научная группа, преобразованная в 1998 году в лабораторию биохимии вирусных РНК, под руководством Александра Четверина — ныне доктора биологических наук, члена-корреспондента РАН.

Целью создания группы Четверина была разработка методов эффективного внеклеточного размножения молекул РНК. Размножение (клонирование) молекул РНК и ДНК бывает необходимо при генетических, иммунологических и других молекулярно-биологических исследованиях; в медицине — для диагностики многих болезней: от вирусных до онкологических. На долгом пути к достижению этой цели сделан ряд важных открытий и изобретений. В том числе был изобретён метод молекулярных колоний (если сокращенно, ММК).

Особенность этой научной новинки в том, что молекулы, несущие наследственную информацию, РНК и ДНК, размножаются не в жидкой, как это обычно принято, а в особой среде — геле. Благодаря этому потомство каждой молекулы образует колонию, а не распространяется в жидкости по всему объёму.

Таким образом, отдельную молекулу можно размножить до детектируемого числа идентичных молекул, что даёт возможность обнаружить, идентифицировать и подсчитать единичные молекулы. Ведь каждая колония представляет собой молекулярный клон (множество копий первоначально помещённой в данную точку геля молекулы). А число колоний указывает на число молекул ДНК или РНК, находящихся в геле до начала реакции.

Но успех к пущинской группе пришёл не сразу. Преграды, стоявшие на пути исследователей, были довольно серьёзными. Сравним, например, размеры объектов исследования Коха и группы Четверина. Бактерии — чаще всего одноклеточные прокариотные (безъядерные) микроорганизмы — имеют микронные размеры (1 микрон = 10^-4 сантиметра), в то время как молекулы ДНК или РНК — наномолекулы (1 нанометр = 10^-7 сантиметра), то есть они на несколько порядков меньше бактерий.

Кроме того, если бактерии и вирусы — существа достаточно сложной, но всё же целостной, можно даже сказать, автономной, самодостаточной организации, то ДНК и РНК — лишь детали (пусть и важные) живой клетки, которые предстояло выделить из клетки (изолировать) и размножить. Такие отдельные изолированные макромолекулы — субстанции гораздо более уязвимые, чем бактерии.

Подобно тому, как организм состоит из отдельных органов, клетка сконструирована из многих частей, ответственных за питание, размножение и выделение всего ненужного. Многочисленны составные части, компоненты живой клетки. В ней находятся ядро, ядрышко, митохондрии (в животных клетках), хлоропласты (в растениях), лизосомы, аппарат Гольджи, вакуоли, центриоли и так далее. Плюс внешние и внутренние мембраны, делящие клетку на обособленные отсеки, в которых она создаёт свои собственные белки, жиры, углеводы… Вот в каком хитроумном биоцарстве привычно обитают молекулы наследственности ДНК и РНК.

Биологам требовалось не только извлечь из клетки эти молекулы, но и, главное, создать для них искусственную среду обитания. Какая аналогия тут сразу приходит в голову? Конечно, осваивающий враждебный космос (невесомость, отсутствие атмосферы, нулевое давление) человек. С его скафандрами, орбитальными станциями с запасами пищи, воды, всяких систем жизнеобеспечения, всего того, что имитирует полноценную жизнь человека на Земле. Так что Четверин и его сотрудники должны были провести нечто вроде «космизации» молекул ДНК и РНК.

В качестве основной системы размножения молекул учёные выбрали полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Этот метод широко применяется в биологии и медицине. Но в отличие от традиционной ПЦР, которая проводится в жидкости, исследователи из Института белка решили осуществлять реакцию в специально приготовленной пористой гелеобразной массе.

Теперь — подробности. Мы уже отмечали, что РНК и ДНК — наномолекулы. Оказывается, матрикс (основное вещество) геля образует трёхмерную сеть с размерами пор также в нанометровом диапазоне. Это обстоятельство и позволяет называть колонии Четверина колониями наномолекул, или просто наноколониями.

Использование иммобилизованной среды — ключевой момент: матрикс геля предотвращает конвекцию среды, препятствует диффузии наномолекул. Поэтому потомство исходной молекулы концентрируется в ограниченной зоне вокруг родительской молекулы. Одновременно сама матриксная сеть не оказывает влияния на диффузию более мелких молекул — всего того, что необходимо для размножения молекул ДНК и РНК, для доставки к ним всех субстратов реакции.

В ожидании новых тест-систем

Метод молекулярных колоний можно использовать во многих областях: для сверхчувствительной диагностики вирусов и рака, а также для внеклеточного клонирования и скрининга генов, вплоть до идентификации генов по функции кодируемых белков.

Тесты, разработанные группой Четверина, гарантируют достаточно быстрый результат. Выделение нуклеиновых кислот из образца крови занимает от получаса до нескольких часов, затем ещё около двух часов необходимо для проведения самой реакции.

Сотрудники Института белка уже использовали свой метод для диагностики ряда инфекционных заболеваний, в частности на примере РНК вируса СПИДа и ДНК вируса гепатита В. Экспериментально доказано: чувствительность нового метода гораздо выше, чем у старых методов, основанных на размножении РНК или ДНК в жидкости.

В лаборатории биохимии вирусных РНК работают и над диагностикой онкологических заболеваний. Диагностировать рак исследователи хотят путём обнаружения в клинических образцах крови молекул РНК, которые наличествуют во всех без исключения раковых клетках. Пример такого универсального маркера — матричная РНК (мРНК) белка теломеразы, фермента, отвечающего за синтез концевых участков хромосом (теломер). Эта же мРНК есть и в нормальных стволовых клетках, которые, подобно раковым, обладают способностью к неограниченному делению. Однако последние находятся в своих нишах и не распространяются по организму. Так, присутствие теломеразной мРНК там, где стволовых клеток быть не должно (например, в плазме крови), может однозначно указывать на наличие в организме злокачественного процесса. Александр Четверин считает, что при наличии всех необходимых контрольных тестов можно будет точно сказать, болен человек раком или нет.

Разработанная методика универсальна и может пригодиться не только в медицине. Применение наноколоний может быть весьма полезным и для различных областей биотехнологии, сельского хозяйства, криминалистики, мониторинга окружающей среды, фундаментальной науки, наконец. Это могут быть химия одиночных молекул, бесклеточное клонирование и скрининг генов, секвенирование, молекулярная диагностика… Метод молекулярных колоний (ММК), или просто метод наноколоний (МН), со временем неизбежно станет развитой технологией, обладающей уникальными возможностями и высоким потенциалом для решения научных и прикладных задач.

***

Размножение ДНК в клетке

Молекула ДНК самовоспроизводится (копирует сама себя) при каждом клеточном делении. При этом слабые связи между двумя цепями двойной спирали ДНК разрушаются, в результате чего цепочки разделяются. Затем на каждой из них строится вторая цепь ДНК, комплементарная первой. В результате при делении клетки происходит удвоение исходной молекулы ДНК, так что в обеих клетках оказывается по одной полной копии ДНК. Этот процесс называется репликацией. Так генетическая информация, заключённая в ДНК, полностью сохраняется при клеточном делении.

№1, 2011