«Вся философия, — сказал интеллектуал XVII века Фонтенель, — основана на двух вещах: любопытстве и плохом зрении». Человек всё время пытается понять больше, чем может увидеть глазами. Поэтому первые микроскопы произвели в просвещённом европейском обществе фурор. Конструкция из выпуклых и вогнутых линз подтвердила то, о чём давно, но бездоказательно говорили натурфилософы: на самом деле вещи устроены совсем не так, как выглядят снаружи. На микроуровне гладкое оказывается шероховатым, сплошное — прерывистым, целое — состоящим из кусочков, и от устройства этих кусочков, возможно, зависят свойства целого. Энтузиазм, с которым был воспринят открывшийся глазу микромир, сравним разве что с сегодняшним пафосом нанотехнологий: казалось, ещё чуть-чуть, и человек увидит наконец собственными глазами, из чего состоит вещество; обнаружит гармонию, симметрию и эстетику, которую (как учила вся предшествующая умозрительная премудрость) Бог/природа заложили в материю с целью преподнести человеку некий моральный урок.

Страница из труда Генри Бейкера — своеобразного «учебника по микроскопии» — изображает однолинзовый микроскоп его современника Антони ван Левенгука.

Разница между открытой и закрытой платформами делается понятной при взгляде на микроскопы Интегра (слева) и Солвер (справа).

Реальность — к сожалению или к счастью — не оправдала этих страстных и нетерпеливых ожиданий. Вместо гармонии, симметрии и моральных уроков Левенгук показал человечеству сперматозоид, и это ещё был один из лучших результатов.

История не даёт точного ответа на вопрос, кто изобрёл первый микроскоп; она, скорее, склонна хранить имена тех, кто достиг в устройстве совершенства, нежели создателей сырого прототипа. Однако с высокой долей вероятности первенство приписывается Янсенам, голландскому семейному предприятию изготовителей очков для чтения, и датируется 1590—1595 годами. Известно, что янсеновский двухлинзовый микроскоп увеличивал в 9 раз и что оптика стала для Янсена-младшего полезным хобби — он промышлял чеканкой фальшивых монет.

В начале XVII века микроскоп представлял собой популярнейший гаджет — в любом уважающем себя доме ему полагалось украшать кабинет хозяина независимо от рода занятий последнего. Изготовление микроскопов для интерьера сделалось было хорошей коммерцией, но ненадолго, потому что научная применимость прибора вызывала всё больше скептицизма. В погоне за увеличением терялось разрешение — качество изображения было тем хуже, чем крупнее план. Кроме того, единственным способом зафиксировать картинку на бумаге был художественный талант наблюдателя, а сам наблюдатель часто грешил интерпретациями, вкладывая в описание картинки то, что он ожидал на ней увидеть. «Глаз пчелы имеет вид выпуклого овала, чёрного, испещрённого бесчисленными отверстиями, подобно напёрстку, и, что ещё удивительнее, мы видим, что эти поры представляют собой многоугольники, подобные сотам, и в них торчат волоски, как в порах человеческой кожи. Отверстия же не сквозные, а представляют собой углубления в роговице...» — это описание можно считать одним из наименее фантастических. Много и эффективно потрудившийся для науки голландец Николаас Хартсокер в 1694 году честно «увидел» внутри сперматозоона микроскопического младенца, а англичанин Вильям Крун в 1671-м — цыплёнка в зародыше куриного яйца.

Помимо добросовестных ошибок интерпретации, когда тени и помехи принимались за структурные особенности препарата, весьма относительная проверяемость данных, полученных под микроскопом, служила питательной средой для разного рода мошенников. Левенгуку довелось разоблачить одного из таких шарлатанов: «черви, пожирающие сукно», которыми сообразительный микроскопист запугивал сукноторговцев, оказались заранее нанесённой на линзы перфорацией.

Левенгук стал одним из главных участников научной коммуникации XVII века. Однако позже Генри Бейкер, английский натуралист и автор первых учебников по микроскопии, был вынужден констатировать, что Левенгук либо частично выдумал свои наблюдения, либо — что вероятнее — продемонстрировал Королевскому научному обществу наименее совершенные из своих инструментов, а самые совершенные, которые сделали возможными его исключительные результаты, утаил. Антони ван Левенгук был коммерсант — всю жизнь успешно торговал гардинами, он и линзами впервые занялся, чтобы дотошно изучать качество тканей; цену своим достижениям в области микроскопии отлично понимал и не стремился ими делиться.

Дорога за пределы света

Ко второй половине XVII века микроскопии уже удалось многое. Уже увидели эритроциты и двухклеточную стадию развития оплодотворённой лягушачьей яйцеклетки. Уже Роберт Гук описал клетку пробки (и ввёл сам термин «клетка» в научный обиход), а Марчелло Мальпиги, анатом из Болоньи, показал, что кажущиеся однородными ткани человеческого тела имеют сложную структуру. «Но что это даёт практической медицине?» — спрашивал оппонент Мальпиги болонский профессор медицины Джироламо Сбаральи. Знание структуры костной ткани не помогает сращивать переломы, наблюдения за сперматозоидами не способствуют лечению бесплодия; всё, что можно было сколько-нибудь достоверно увидеть в микроскоп, уже увидели. «Общеизвестно, что микроскопические исследования не принесли медицине никакой пользы», — резюмировал он.

Напрасно Гук в посвящённых микроскопии работах уверял, что главные открытия впереди. Научная общественность «голосовала ногами»: микроскопы перестали покупать. Из отрасли ушли деньги, и она замерла до 1830 года.

Дело в том, что микроскопы Левенгука «видели» так много и так хорошо отчасти потому, что были однолинзовыми. Громоздкие, неэстетичные и неудобные, при достаточной оптической силе линзы такие устройства позволяли получать высокоинформативные изображения, а в деле изготовления линз Левенгуку не было равных. Составные же микроскопы, удобные и элегантные кабинетные игрушки, которыми увлекалось большинство производителей XVII века, стремились наращивать увеличение, совмещая в своём устройстве несколько линз, однако результат получался пусть и «крупнее», но гораздо менее информативный, дающий большой простор фантазии интерпретатора. Световые лучи преломляются под разными углами в зависимости от длины волны и, кроме того, по-разному отражаются от линзы в разных точках в зависимости от её кривизны. Поэтому результирующая картинка, наблюдаемая в составной микроскоп, оказывалась «зашумлённой», искажённой по краям и тем более дефектной, чем больше использовалось линз. Только в 1830 году этот порок составных микроскопов удалось преодолеть, связав показатели преломления лучей с расстоянием между линзами. В конце XIX века лучшие микроскопы позволяли разглядеть структуры до одного микрона. Ещё сто лет потребовалось, чтобы достичь физического предела: с появлением конфокальных лазерных микроскопов границы «видимости» раздвинулись до теоретически возможных 200 нм. Однако уже в 1933 году был предложен способ, как перешагнуть и этот рубеж, такая возможность появилась с изобретением электронного микроскопа.

Сегодня сосуществуют на равных три основных направления в микроскопии: оптическая, электронная и зондовая. Первые два похожи между собой по набору принципиальных возможностей и ограничений, а вот третье — зондовая микроскопия — отличается очень сильно. В чём же это отличие?

От микроскопа к «нанощупу»

В фильме известного режиссёра Джима Джармуша «Ночь на земле» парижский таксист — грубоватый мужлан африканского происхождения — везёт слепую девушку, бледную, изящную и утончённую. Он её спрашивает: «Вы не носите чёрных очков, разве слепые не всегда носят чёрные очки?» На что она отвечает: «Понятия не имею! Я никогда не видела слепых». Но когда таксист решил из жалости скинуть четверть цены за поездку (по незнакомому для неё пути), девушка возмутилась и назвала правильную цену по счётчику с ошибкой меньше 1%. Она чувствовала расстояние!

Световой микроскоп — это прибор, предназначенный для усиления возможностей человеческого зрения. По сути, это очень сложная надстройка к глазу, изощрённая система линз и осветителей, увеличивающих объект и делающих его более контрастным. Естественно, то, что меньше 200 нм, в оптический микроскоп увидеть по-прежнему невозможно, но «невозможно» в микроскопии означает вот что. Точечные объекты всегда предстают перед «вооружённым глазом» как некое распределение оптического сигнала. По формальному критерию, принятому в аппаратных наблюдениях, они считаются отдельными, если распределение сигнала от них перекрывается не больше чем на две трети. Если они расположены так близко друг от друга, что перекрытие сигнала больше этого условного значения, наблюдатель обязан рассматривать объект как единичный.

Когда мы имеем дело с волной, мы не можем «собрать» её в пучок ýже, чем половина её длины. Поэтому минимальное расстояние, на котором можно распознать объекты как отдельные, это половина длины волны излучения, создающего оптический сигнал. Видимый глазом свет имеет длины волн от 400 нм (синий) до 750 (красный). То есть если наблюдения проводить в синем свете, то принципиальным ограничением как раз и будут те самые 200 нм. Следовательно, «последнее», что видно в оптический микроскоп, это некоторые внутриклеточные структуры: например, митохондрии или ядро. Можно увидеть и хромосому, а вот ДНК внутри хромосомы — уже нет, потому что диаметр нити ДНК — всего 2,5 нм.

Этот физический барьер преодолевают электронные микроскопы. Они работают по тому же принципу, что оптические, только вместо луча света используется пучок электронов, потому что его длина волны значительно короче — десятые и сотые доли нанометра. Однако электрон, во-первых, всё «бомбит» на своём пути, будучи высокоэнергетической частицей, а во-вторых, разгоняется только в вакууме, соответственно в вакууме должен находиться и препарат. Поэтому «живые» образцы исследовать методами электронной микроскопии невозможно.

Сканирующая зондовая микроскопия, которая появилась в 80-е годы прошлого века, основана на совершенно ином принципе. Такой микроскоп не «видит», а «чувствует» объект с помощью специальной иголки — зонда. Зонд позволяет регистрировать очень слабые взаимодействия (притяжение, отталкивание, электрический ток), которые возникают между атомами острия зонда и атомами поверхности. Зондовый микроскоп последовательно ощупывает исследуемый участок поверхности — сканирует его, строчка за строчкой.

Такой подход имеет свои плюсы и минусы. Например, если человек действует только на ощупь, он не знает, прозрачен предмет перед ним или нет. Так и СЗМ (сканирующая зондовая микроскопия) даёт информацию только о поверхности объекта. Правда, в отличие от человека, прибор может собирать гораздо больше информации о ней. Например, зонд может «чувствовать» распределение магнитных полей над поверхностью, строить карту вольт-амперных характеристик или определять степень «липкости» (по-научному — адгезивности) в каждой точке исследуемого участка. И всё это с пространственным разрешением вплоть до единиц нанометров (разрешение определяется только тем, насколько острый у зонда кончик, который непосредственно взаимодействует с образцом).

Ещё одно принципиальное отличие СЗМ от двух других разновидностей микроскопии — световой и электронной состоит в том, что сканирующий микроскоп строит карту поверхности с точными количественными значениями измеряемого параметра в каждой точке. Например, в самом простом случае это рельеф. Поскольку микроскоп совершенно точно «знает», на какую высоту ему пришлось поднять или опустить зонд, прежде чем остриё коснулось поверхности, любые две точки на исследуемом участке можно сравнить между собой. Но если глазом на местности (или «усиленным» глазом в микромасштабе) мы в лучшем случае можем качественно сравнить две неровности (выше-ниже), то СЗМ даёт точное количественное значение — точка А находится на 27,3 нм выше, чем точка Б.

Специалисты утверждают, что 70% людей бóльшую часть информации о внешнем мире получают через зрение. Однако у каждого из нас есть несколько каналов, по которым мы можем, хотя бы потенциально, исследовать мир, — зрение, осязание, вкус, обоняние, слух, некоторые говорят ещё об интуиции… Наверное, было бы здорово соединить вместе сразу несколько разновидностей микроскопии, чтобы воспользоваться преимуществами каждого из подходов. Именно в этом направлении шло развитие СЗМ, и, как оказалось, естественное и понятное желание исследовать один и тот же объект всесторонне привело к совершенно неожиданным результатам.

«Одинокий голос» молекулы

За более чем четырёхвековую историю существования световой микроскопии учёные приспособили свет для получения гораздо более обширной информации об объекте, чем просто возможность его рассмотреть. Например, умение раскладывать свет в спектр, то есть анализировать соотношение разных по характеристикам квантов, открыло путь для спектроскопических исследований. Луч света может взаимодействовать с веществом, при этом соотношение квантов с разными характеристиками (спектр) меняется. Облучая образец светом известного состава и анализируя спектр отражённого или прошедшего насквозь света, мы можем узнать о том, какие молекулы входят в состав образца и как они связаны друг с другом, в каком состоянии находится кристаллическая решётка кристалла, есть ли в ней напряжения, дефекты, и получить ещё много другой полезной информации.

Понятно, что любой из методов оптической спектроскопии основан на использовании луча света, а значит, ограничен в пространственном разрешении физическим пределом в 200 нм. Именно таков минимальный диаметр пятна, в которое мы можем сфокусировать луч синего света с помощью самой совершенной оптики. Поэтому в лучшем случае у нас получится «познакомиться» одновременно с несколькими сотнями, иногда десятками молекул, но никогда — с одной молекулой.

Есть ещё одна проблема — интенсивность сигнала. Представим, что на рок-концерте исполнитель предлагает: «А теперь все вместе!» И половина слушателей (которые знают слова) начинают петь. Получается тише, чем в динамиках, но всё-таки слышно. А если вдруг музыкант со сцены позовёт Васю и Вася откликнется, то его за шумом никто не услышит. Услышать «голоса молекул» помогает исследователю один из самых востребованных сегодня методов — спектроскопия комбинационного рассеяния. Она даёт информацию и о том, какие молекулы есть в образце (своего рода химический анализ), и о том, в каком состоянии эти молекулы находятся. Но комбинационное рассеяние квантов света происходит редко — из 10 миллионов квантов, которые падают на молекулу, только один рассеивается с потерей энергии (именно эта потеря и даёт характерное изменение спектра). Если у нас миллион одинаковых молекул, то со временем мы сможем накопить достаточное количество «изменённых» квантов, чтобы их можно было достоверно зарегистрировать — выделить из шума и посчитать. Но если мы хотим обнаружить только одну молекулу, придётся ждать годы!

Когда исследователи соединили вместе оптический микроскоп с зондовым, просто для того, чтобы и видеть и чувствовать объект одновременно, проблема спектроскопии молекул разрешилась неожиданным образом.

Дело в том, что на наноразмерных неровностях свет ведёт себя особым образом. В частности, теория предсказывает, что при определённых соотношениях материала, размеров и формы наночастиц сигнал комбинационного рассеяния на них может усиливаться в миллионы раз. Это свойство света оказалось бесценным для исследований в наномасштабе. Представим себе луч лазера (в современных оптических микроскопах используется именно такой свет), сфокусированный в пятнышко диаметром 200 нм, и внутри этого пятнышка находится зонд с наночастицей серебра на острие. При сканировании поверхности исследователь получает сигнал комбинационного рассеяния из каждой точки одновременно с данными о высоте рельефа, а также об отражении и пропускании света. Если в процессе сканирования в пятно света попадёт интересующая нас молекула, она начнёт давать сигнал, но сигнал будет очень слабым, и мы его не сможем заметить. Но как только молекула окажется вблизи наночастицы серебра на острие зонда, сигнал от неё возрастёт многократно и станет вполне измеримым.

Отечественный прибор Интегра Спектра, в котором соединены вместе два микроскопа — оптический и зондовый, был включён в престижный список 100 лучших мировых разработок, по версии американского журнала R&D* за 2006 год, когда стало понятно, что такое соединение позволяет решить сразу две проблемы — слабого сигнала комбинационного рассеяния и низкого пространственного разрешения оптических методов спектроскопии в целом. В 2010 году две лаборатории — в Швейцарии и Великобритании — независимо друг от друга получили с помощью российского прибора разрешение при спектроскопии молекул 15 и 14 нм соответственно.

Не следует думать, что пространственное разрешение до молекул методами зондового сканирования — это тривиальная задача. Поражающая воображение картина атомной решётки, «увиденной» с помощью зондового сканирующего микроскопа, на самом деле изображает не непосредственно атомы, а распределение туннельного тока между металлической иглой зонда и поверхностью в разных точках. Конечно, можно достаточно уверенно сказать, что такое распределение, скорее всего, обусловлено атомарной решёткой и что рисунок этих «круглых горбушек», скорее всего, отражает строение атомарной решётки. Но это не значит, что мы «ткнули» в атом иголкой и «ощупали» его. За возможность «увидеть» с помощью туннельного сканирования атомную решётку Герд Карл Бинниг и Генрих Рёрер из цюрихской лаборатории IBM получили Нобелевскую премию в 1986 году. Но на то, чтобы «ощупать» атом зондом непосредственно, потребовалось ещё пятнадцать лет.

Сейчас это умеют делать научные микроскопы в специальной комплектации. Разумеется, зонды тоже нужны специальные, потому что у двадцатидолларового кремниевого зонда радиус кривизны примерно 10 нм, а атомный масштаб — это доли нанометра. Нанометровые зонды производители делают каждый по-своему: кто выращивает усик, кто приклеивает нанотрубку, кто затачивает остриё ионным пучком. Общая между такими зондами только цена: порядка тысячи долларов. «Поскрести атом» — это пока весьма дорогое удовольствие.

Зато «поскрести иголочкой молекулу» потенциально может уже любой старшеклассник.

Микроскоп «антивандальный»

Прибор под названием «Наноэдьюкатор» похож одновременно на кухонный тостер и на антивандальную телефонную будку, и это сходство не случайно.

Идею подал Жорес Алфёров ещё в 2002 году. Уже было понятно, что зондовый микроскоп станет одним из главных инструментов для работы в наномасштабе, и появилась революционная мысль: сделать сканирующий зондовый микроскоп для студентов.

Революционная — потому, что профессиональный зондовый микроскоп — устройство хрупкое, нежное и дорогое. Студентов к нему не подпускают по двум причинам: во-первых, студент его почти наверняка сломает, а во-вторых, купить новый на замену мало какой отечественной лаборатории по карману, не говоря о средней школе. Учебный прибор по определению должен быть на сто процентов fool-proof — «дуракоустойчивым», дешёвым в эксплуатации — и при этом оставаться зондовым микроскопом.

Решением этой парадоксальной задачи стал Наноэдьюкатор.

В профессиональных научных приборах для СЗМ важный элемент сам зонд — кремниевая «иголочка», обычно ещё и подвешенная на кремниевой «ниточке». Конструкция хрупкая, ломается легко, для научной лаборатории — расходный материал, потому что стоит порядка 20 долларов. Но тратить 20 долларов за один урок для школьников или студентов в 2002 году было нереалистично. Поэтому принципиальными вопросами в разработке стали «неубиваемость» учебного прибора и его дешевизна. Корпус Наноэдьюкатора согнут из металла, вся начинка жёстко прикручена внутри, а зондом в учебной модели служит вольфрамовая проволочка — дешёвая, поставляется сразу метрами. Из проволочки электрохимическим способом вытравляется заострённая вольфрамовая игла, которую можно затачивать самостоятельно неограниченное количество раз. Интересен и интерфейс — несколько приборов соединены в сеть, а преподаватель со своего компьютера может не только видеть, что делает каждый из студентов на своём приборе, но и перехватывать управление, если студент слишком уж очевидно намеревается совершить ошибку. Возможно и дистанционное управление по сети интернет.

Вторая версия Наноэдьюкатора получила признание в R&D-100 в 2011 году за идею универсального «микроскопа-трансформера». Дело в том, что если заменить вольфрамовый зонд Наноэдьюкатора на стандартный кремниевый, то школьный тренажёр превращается в полноценный научный прибор.

Новый Наноэдьюкатор логично замкнул продуктовую линейку компании НТ-МДТ. Это младший брат другого лауреата списка R&D-100 — Солвера Некст, который по революционности заложенной в него идеи можно сравнить с «цифровой мыльницей» в области фотографии, а в автомобильной истории — с автоматической коробкой передач.

Четырнадцать моторов вместо десяти пальцев

Один из самых мощных трендов во всех наукоёмких отраслях — создание прибора настолько «самостоятельного», чтобы за него можно было посадить любого неподготовленного человека. Солвер Некст — образец вторжения этой идеологии туда, где она казалась неприменимой. Десятки настроечных винтиков, которые в микроскопах с открытой платформой человек крутит пальцами, в Солвере Некст заменяют четырнадцать моторов. Настройки программируются автоматически. Оператору в большинстве случаев остаётся вставить образец и несколько раз нажать на кнопку в управляющей программе.

Про учёных часто говорят: у одного «есть руки», и у него прибор работает, а у другого «руки не так растут», и прибор барахлит. Чтобы получить результат на зондовом микроскопе, мало просто крутить, надо очень многое чувствовать буквально на кончиках пальцев. Поэтому мотор очень отличается от человеческих рук, и сделать его если не таким же, то почти таким же «умным» — задача из категории вызывающих. Во-вторых, моторы шумят. Размещать рядом с иголочкой, которая чувствует нанометры, источник механической вибрации — это всё равно, что проигрывать виниловую пластинку, скача верхом на лошади. Поэтому не удивительно, что первая версия Солвера задержалась с выпуском года на два против плана, прежде чем всё заработало и смогло быть сертифицировано по международным стандартам зондовой микроскопии.

Продолжая аналогию с автоматической коробкой передач, которую некоторые считают решающим фактором эмансипации женщин, «эмансипирующий эффект» Солвера Некст трудно переоценить. Традиционно люди, работающие с зондовыми микроскопами, приобретают квалификацию годами. (И это ещё неплохо, потому что на то, чтобы в совершенстве освоить электронный микроскоп, нужны десятилетия.) Студент начинает работать с прибором на четвёртом курсе — осторожно и под присмотром; потом защищает диплом по зондовой микроскопии и ещё три года работает в ней как аспирант, прежде чем, наконец, сделается не страшно подпустить его к прибору одного. А за Солвер можно посадить лаборанта, вчерашнего школьника, вооружённого пошаговой инструкцией, где первым пунктом идёт «включить в розетку», и, пока он будет делать тысячи рутинных измерений, учёный может заняться наукой. Кажется, это называется разделением труда.

Комментарии к статье

*R&D — американский журнал Research & Development («Исследования и разработки»). Каждый год он составляет список ста самых интересных разработок мира, коммерциализованых в прошедшем году, причём оценивается именно идея. В своё время в список R&D-100 попадали фотовспышка, ксерокс, пластырь от курения, HD-телевизоры.

№9, 2011