Любой геном можно сравнить с текстом. Или с книгой — так даже нагляднее: есть книги потолще, есть книги потоньше, есть сложные, есть простые.

Эммануэль Шарпантье. Фото: Bianca Fioretti, Hallbauer & Fioretti/Wikimedia Commons/CC BY-SA 4.0.

Дженнифер Даудна. Фото: Duncan.Hull/Wikimedia Commons/CC BY-SA 4.0.

Работа системы CRISPR-Cas9 у бактерий. Последовательность CRISPR копируется в длинную РНК, которая называется pre-crRNA; также в РНК копируется информация о белке Cas9, чтобы потом на этой РНК синтезировать сам белок. Информация о белке Cas и последовательность CRISPR находятся рядом в одной и той же цепочке двухцепочечной ДНК. На другой ДНК-цепочке, которая комплементарна первой, синтезируется ещё одна РНК — tracrRNA, или транс-crRNA. Приставка «транс-» означает, что эта РНК зашифрована не в той же ДНК-цепочке, в которой зашифрована crRNA, а в комплементарной ей. На длинную pre-crRNA садятся белок Cas9 и tracrRNA. Белок Cas9 дополнительно скрепляет соединившиеся РНК, после чего другой белок — фермент РНКаза — расщепляет pre-crRNA так, что получается тройной комплекс из белка Cas9 и двух небольших молекул РНК: crRNA и tracrRNA. Теперь система CRISPR-Cas9 готова к работе. Когда в бактерии появится вирусная ДНК, crRNA узнает её, и как только crRNA прочно свяжется с вирусной ДНК, tracrRNA активирует белок Cas9 и он разрежет вирусную ДНК.

Схема работы геномного редактора. РНК-проводник синтезирован так, чтобы слипнуться с определённым участком в клеточной ДНК. Когда РНК-проводник найдёт этот участок, он активирует Cas9, и тот разрежет обе цепи ДНК. Затем клеточные белки, занимающиеся ремонтом ДНК, соединят обе цепи ДНК обратно, скопировав в место разреза ДНК-шаблон, который мы вносим в клетку вместе с системой CRISPR-Cas9.

Любой геном можно сравнить с текстом. Или с книгой — так даже нагляднее: есть книги потолще, есть книги потоньше, есть сложные, есть простые. В книге буквы соединены в слова. Азотистые основания, из которых состоит ДНК, называют генетическими буквами — это аденин (А), тимин (Т), гуанин (G) и цитозин (C). И они тоже складываются в «слова» — соединяясь по три, азотистые основания кодируют аминокислоты. А «слова»-тройки складываются в предложение — последовательность большой белковой молекулы, состоящей из множества аминокислот.

Как и в любом тексте, в геноме тоже случаются ошибки, которые называют мутациями. Большинство мутаций ни на что не влияют. Случаются мутации, которые приносят пользу. И есть мутации, которые вредны. Если ошибки-«мутации» происходят в обычном тексте, их исправят корректоры и редакторы. У живых клеток тоже есть свои корректоры и редакторы, исправляющие погрешности в ДНК — специальные ферменты, входящие в так называемые системы репарации (за расшифровку механизмов ДНК-репарирующих систем в 2015 году дали Нобелевскую премию по химии). Но они не всегда исправляют то, что нужно исправить. Может, стоило бы сконструировать какой-нибудь молекулярный редактор, который мы запускали бы в клетку, и он исправлял бы в ней нежелательные мутации?

Метод CRISPR-Cas9 — как раз один из таких редакторов. В последние годы о нём говорят и пишут чрезвычайно много. Может показаться, будто это единственный метод редактирования генома. На самом деле нет: идея переписывать генетический текст в ДНК возникла давно, и по мере развития молекулярной биологии стали появляться соответствующие экспериментальные техники. Но по-настоящему совершенный метод редактирования генома должен быть точным, универсальным и удобным. Точный метод будет вносить правки только туда, куда нужно, без непредсказуемой самодеятельности. Универсальность означает, что можно выбрать для правки любое место в любой хромосоме. А удобство означает скорость и простоту в обращении. CRISPR-Cas9 не абсолютно точен, не абсолютно универсален и не слишком прост, но для сегодняшней науки он стал поистине революционным.

Однако оценить в полной мере его революционность неспециалисту мешает то, что за CRISPR-Cas9 стоит чрезвычайно непростая наука. Для начала, как расшифровывается CRISPR? Это Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами. А Cas9 — это CRISPR-ассоциированный (CRISPR-associated) белок 9. Что это за повторы, где эти группы и почему с ними ассоциированы какие-то белки?

Бактерии против вирусов

Биологи не с нуля придумали CRISPR-Cas9, а подсмотрели её у бактерий и архей. У них CRISPR-Cas9 работает как система противовирусной защиты. В конце 80-х годов XX века в ДНК кишечной палочки и других микробов открыли странные структуры: группы из палиндромных участков, между которыми находились какие-то другие генетические последовательности. Палиндромами называют последовательности нуклеотидов, которые одинаково читаются от конца к началу и от начала к концу, например, как слово «топот». Открытые группы палиндромных последовательностей назвали CRISPR. Но самое интересное было в том, что находилось между палиндромами — а между ними находились фрагменты вирусных последовательностей.

Когда бактериальный вирус (или бактериофаг) нападает на бактерию, он впрыскивает в неё свою нуклеиновую кислоту и начинает размножаться. Бактерия может погибнуть, а может выжить и избавиться от вируса. Выжившие бактерии встраивают фрагменты вирусной ДНК* в свой геном, в участки CRISPR. То есть, образно говоря, CRISPR — это картотека, хранящая информацию о вирусных атаках. Если в клетке снова окажется чужая ДНК, бактерия сравнит её с картотекой CRISPR и, если найдёт совпадение, быстро уничтожит, не дав вирусу ни шанса. Хотя фрагменты вирусных последовательностей в CRISPR довольно короткие, их вполне хватает, чтобы узнать вирус. Так мы, открыв книгу без обложки, быстро поймём, с чем имеем дело, если увидим в каком-нибудь предложении имя Анны Карениной.

Разумеется, здесь не обойтись без белков. CRISPR-последовательность в ДНК сначала копируется в одну большую РНК, потом эта РНК разрезается на кусочки. Эти кусочки должны прочно связаться с чужой ДНК, то есть между их нуклеотидами должны образоваться комплементарные водородные связи. Если какие-то нуклеотиды провзаимодей-ствовали, а какие-то нет — значит, перед нами никакой не вирус. Но если кусок РНК, синтезированный на картотеке CRISPR, и чужая ДНК сцепились друг с другом, как родные, эту нуклеиновую кислоту надо резать.

Все эти процедуры выполняют белки Cas. Сейчас их в сумме насчитывается уже девяносто три, их гены хранятся в бактериальной хромосоме рядом с CRISPR-картотекой (откуда и аббревиатура Cas — «CRISPR-ассоциированные»). Не все девяносто три белка работают вместе во всех бактериях и археях. Систем CRISPR-Cas есть более двадцати разновидностей, которые отличаются и набором белков, и некоторыми особенностями работы. (В дальнейшем мы будем говорить о системе CRISPR-Cas9, в которой работает белок Cas9.) Но в целом все они заняты одним и тем же: пополнением картотеки CRISPR, поиском потенциально опасных ДНК в клетке, истреблением вирусов и пр. Часто картотеку CRISPR и обслуживающие её белки Cas называют бактериальным иммунитетом. Конечно, иммунная система животных работает совсем иначе, однако у них есть и кое-что общее: и наш иммунитет, и система CRISPR-Cas узнают и уничтожают опасного чужака по памяти о прошлых инфекциях. У нас память о прошлых инфекциях хранят специальные иммунные клетки, у бактерий — специальный участок в бактериальной хромосоме.

Молекулярные хитрости «бактериального иммунитета»

Хотя впервые на последовательности CRISPR обратили внимание ещё в конце 1980-х, окончательно подтвердить гипотезу о «бактериальном иммунитете» удалось только к 2007 году, а потом ещё несколько лет ушло на то, чтобы расшифровать молекулярный механизм. Чтобы подойти к исследованиям нынешних лауреатов, надо чуть дальше зайти в «дебри» молекулярной биологии. Как сказано выше, CRISPR-участок ДНК со всеми вирусными последовательностями копируется в длинную РНК. Но в таком длинном виде эта РНК работать не может — её нужно нарезать на небольшие фрагменты. Каждый фрагмент несёт в себе образец какого-то одного вируса, и с ним теперь удобно работать Cas-белкам. Длинная РНК, синтезируемая на ДНК с CRISPR, называется pre-crRNA, что означает предшественник CRISPR-RNA. Она должна созреть, то есть разделиться на маленькие кусочки, на множество crRNA, или CRISPR-RNA.

Эммануэль Шарпантье с коллегами сумела описать, как созревает pre-crRNA. Оказалось, что тут нужна другая РНК, которая закодирована в бактериальной хромосоме в некотором отдалении от участка CRISPR-Cas — так называемая tracrRNA (trans-encoded crRNA — транс-кодируемая crRNA, где приставка транс- указывает на то, что tracrRNA закодирована не в той же цепи ДНК, что pre-crRNA, а в параллельной, или, говоря более корректно, комплементарной). Небольшая tracrRNA садится на длинную pre-crRNA в тех местах, где её надо разрезать. Белки Cas, в свою очередь, связываются со спаренными РНК и прочнее скрепляют их друг с другом. Следом приходит фермент, который разрезает длинную pre-crRNA и немного подрезает tracrRNA. В результате получается комплекс из белка Cas и двух РНК — crRNA, в которой записан фрагмент вируса, и вспомогательной tracrRNA.

Роль tracrRNA не ограничивается тем, что она помогает созреть длинной pre-crRNA. Расшифровывая механизм CRISPR-Cas9, Эммануэль Шарпантье начала сотрудничать с Дженнифер Даудной, которая до этого много занималась Cas-белками. Вместе они выяснили, что tracrRNA нужна ещё и для того, чтобы белок Cas9 смог расщепить вирусную ДНК. То есть чтобы узнать, вирус это или не вирус, нужна crRNA, но для того, чтобы фермент сработал и разрушил вирусный геном, нужна РНК-напарница — tracrRNA. Открытие двойной роли tracrRNA стало одним из главных событий в расшифровке механизма системы CRISPR-Cas9.

Рождение генетического редактора

В какой-то момент Даудне и Шарпантье пришла в голову идея, что обе РНК — crRNA и tracrRNA — можно объединить в одну молекулу. Должна была получиться одна РНК, которая бы приводила белок Cas9 к нужному участку в ДНК и одновременно заставляла эту ДНК разрезать. Такую гибридную РНК удалось создать — её назвали sgRNA (то есть single-guideRNA — РНК-проводник). Следующая мысль напрашивалась сама собой: последовательность РНК-проводника в той её части, которая взаимодействует с ДНК, может быть любой. Значит, мы можем синтезировать искусственную направляющую РНК и с её помощью нацелить Cas9 на любой участок в любой ДНК — в ДНК растительной клетки, в ДНК мыши, в ДНК человека, в конце концов.

Опишем в общих чертах, как работает редактор CRISPR-Cas9. Представим, что у нас в каком-то гене есть опасная мутация. Никакой библиотеки CRISPR тут уже не требуется — мы сами синтезируем РНК, которая по своей последовательности совпадает с мутантным участком в ДНК. Эта РНК будет проводником для белка Cas9 — мы вручаем её белку и отправляем в клетку. (Биотехнологические ухищрения, с помощью которых нужные белки и нуклеиновые кислоты попадают в нужную клетку, описывать не будем — это отдельная большая тема.) Cas9 находит нужный мутантный участок и режет ДНК (одну цепь или сразу две — зависит от модификации метода). Но разрезать — не значит исправить. Мы не хотим вообще выключить мутантный ген — мы хотим, чтобы он стал работать, как надо. То есть неправильную, мутантную генетическую букву нужно отредактировать — вырезать её из ДНК и вставить вместо неё правильную. Но сам Cas9 ничего из ДНК не вырезает и не вставляет — он её просто режет.

Исправлением ДНК занимаются так называемые системы репарации ДНК — о них упоминалось в самом начале. Это сложные белковые комплексы, которые распознают различные дефекты в ДНК. Системы репарации есть в любой клетке, и когда в ДНК появляется разрыв, они приходят, чтобы его зашить. Но клетка не просто сшивает разрыв, она заменяет целый кусок ДНК, в который входит и место разрыва, и ещё несколько десятков генетических букв по обе стороны от него. Вместо повреждённого фрагмента синтезируется новый. Чтобы синтезировать такую заплатку, нужен шаблон с правильной последовательностью генетических букв. Обычно системы репарации используют в качестве шаблона другую, неразорвавшуюся цепь ДНК или соответствующий участок из гомологичной хромосомы. Но мы можем предложить и свой шаблон для латания ДНК. Для этого вместе с системой CRISPR-Cas9 мы отправляем в клетку образец ДНК — копию той последовательности, которую хотим отредактировать, только в ней будут уже нужные нам правки. То есть система CRISPR-Cas9 нужна для того, чтобы включить клеточные механизмы ремонта генома, которые в нужном месте перепишут ДНК в соответствии с нашими указаниями.

Как уже говорилось, до появления CRISPR-Cas9 в руках у исследователей были и другие методы редактирования ДНК. Суть их в общих чертах такая же: разрезать ДНК в строго определённом месте, чтобы потом этот разрез залатать в соответствии с некоторым образцом. Но CRISPR-Cas9 оказался намного удобнее. Дело в том, что в других генетических редакторах нужное место в ДНК ищет белок, который потом либо сам режет ДНК-цепи, либо это делает белок-напарник. То есть это сугубо белковые редакторы. Они созданы на основе таких белков, которые от природы взаимодействуют с определёнными последовательностями в ДНК — их нужно только перепрограммировать, чтобы они искали в ДНК другие последовательности букв, другие «слова». Однако перенацелить белок с одной последовательности ДНК на другую довольно непросто, и эту задачу не всегда удаётся успешно решить: белковые молекулы устроены сложно и могут не выдержать подобного экспериментального вмешательства.

С CRISPR-Cas9 всё иначе — тут не белок ищет цель, а РНК-проводник. Направляющая РНК состоит из двух частей: одна — поисковая, которая найдёт в ДНК участок для редактуры, и вторая часть, которая в нужный момент активирует фермент Cas9. Нуклеиновые кислоты взаимодействуют между собой намного проще, чем с белками, так что синтезировать РНК, нацеленную на конкретную ДНК-последовательность, тоже намного проще, чем перепрограммировать для этого белковую молекулу. Более того, РНК можно нацелить на самые разные по-следовательности ДНК, так что с точки зрения редактируемого текста для CRISPR-Cas9 нет ничего недоступного. Однако, структура РНК-проводника такова, что на какое бы «слово» в ДНК она ни была направлена, Cas9 будет с ней работать. Изменять сам белок Cas9 не требуется — он просто идёт туда, куда его ведёт РНК-проводник. В этом смысле система CRISPR-Cas9 проста и универсальна.

Триумф генетического редактора

Разумеется, не только Шарпантье и Даудна изучали бактериальную систему CRISPR-Cas9. Но именно они указали на её ключевые особенности: на то, что белком Cas9 управляют две РНК (crRNA и tracrRNA), что эти две РНК можно объединить в одну и что весь аппарат CRISPR-Cas9 можно направить туда, куда необходимо. Статья Шарпантье и Даудны о том, как приспособить CRISPR-Cas9 для биотехнологических нужд, вышла в 2012 году, и с тех пор число работ по этой теме растёт лавинообразно. Систему CRISPR-Cas9 модифицируют, совершенствуют, испытывают на самых разных организмах: на дрожжах, дрозофилах, круглых червях, на табаке и рисе, на клетках мышей, свиней, собак и людей. Одни варианты CRISPR-Cas9 позволяют резать только одну цепь ДНК, другие варианты режут обе цепи ДНК сразу или же вообще режут не ДНК, а РНК. Есть версии метода, в которых используется дефектный фермент: он не умеет резать ДНК, но зато связан с другим белком, который способен включать или выключать активность тех или иных генов: «увечный» Cas9 с помощью РНК-проводника приходит к нужному гену и просто садится на его ДНК, а белок-пассажир уже дальше делает свою работу.

Революционное значение метода вполне очевидно: включая и выключая гены, внося в них разные мутации, мы лучше понимаем, как они работают в организме, как взаимодействуют между собой и т. д., и с CRISPR-Cas9 подобные исследования стали проходить намного быстрее. Если же говорить о практике, то легко понять, сколь огромные возможности открываются перед нами в смысле исправления вредных мутаций, истребления раковых клеток и т. д. В 2014 году в «Nature Biotechnology» была опубликована статья, авторы которой описывали мышей, избавленных от тирозинемии. Это тяжёлая болезнь обмена веществ, при которой из строя выходят и почки, и печень, и нервная система. Как легко догадаться, мышей от неё избавили, исправив с помощью CRISPR-Cas9 соответствующий кусок в ДНК. Есть исследования, в которых с помощью CRISPR-Cas9 останавливают гибель фоторецепторов в сетчатке и предотвращают слепоту у животных, предрасположенных к пигментному ретиниту — наследственному дегенеративному заболеванию, заканчивающемуся полной слепотой. Минувшим октябрём в «Nature Communications» появилась работа, в которой рассказывалось, как CRISPR-Cas9 помогает целенаправленно истребить у мышей раковые клетки, не тронув здоровые.

Но мыши мышами, а что же люди? У людей CRISPR-Cas9 тоже потихоньку начинают применять. Для примера здесь можно вспомнить прошлогоднее сообщение биотехнологических компаний «CRISPR Therapeutics» и «Vertex Pharmaceuticals», чьи сотрудники вылечили двух пациентов с генетическими заболеваниями крови, бета-талассемией и серповидноклеточной анемией. Смысл лечения был в том, чтобы отредактировать гены у стволовых клеток крови, из которых получаются эритроциты. Редактирование прошло успешно, и кровь больных пришла в норму.

Правда, когда говорят о «человеческом» использовании CRISPR-Cas9, то чаще вспоминают недавние скандалы, связанные с редактированием генов у человеческих эмбрионов. В том, чтобы редактировать именно эмбрион, есть свой смысл: если заранее известно, что ребёнку от родителей достались опасные мутации, что ему суждено стать больным на всю жизнь, то почему бы не исправить ему гены в самом начале? Это проще, чем исправлять гены у полностью сформировавшегося человека. Однако тут возникают разнообразные этико-юридиче-ские вопросы, связанные с проблемой субъектности эмбриона. Вопросы эти до поры до времени вяло тлели в научном сообществе, пока в 2015 году китайские исследователи из Университета Сунь Ятсена не опубликовали в журнале «Protein & Cell» работу, где описывали, как им удалось с помощью метода генной инженерии CRISPR-Cas9 отредактировать геном человеческих эмбрионов. Никто не думал, что эмбрион человека отредактируют так скоро. Этико-юридические дискуссии вышли на новый уровень и достигли апогея, когда в 2018 году в Китае на свет появились две девочки, которых с помощью CRISPR-Cas9 сделали устойчивыми к ВИЧ (во всяком случае, так утверждают исследователи, которые пытались редактировать их эмбрионы).

Сомнения относительно «редактирования» человека основываются не только на том, как нам относиться к эмбриону, но и на особенностях самого метода. Мы говорили, что CRISPR-Cas9 позволяет точно редактировать определённое место в ДНК, но точность его не абсолютна. За последние годы был опубликован ряд работ, которые говорят, что CRISPR-Cas9 пока ещё мало подходит для редактирования человеческих генов — из-за того, что очень велик риск незапланированных мутаций. Проблема в большой вариабельности наших генов: одна и та же последовательность ДНК у двух разных людей может отличаться на одну или несколько букв. Хотя на функции гена такие замены часто никак не влияют, из-за них редактирующая машина Cas9 с направляющей РНК может приземлиться, кроме как в нужном месте, ещё в десятке, а то и в сотне других точек в геноме — по некоторым оценкам, число ошибок может доходить до 10 000. Но у человека есть и такие гены, которые вообще не провоцируют CRISPR-Cas9 ни на какие ошибки, и с ними CRISPR-Cas9 работает исключительно точно.

Вообще точность CRISPR-Cas9 в применении к человеческой ДНК остаётся предметом дискуссий — некоторые исследователи полагают, что данные о множестве CRISPR-ошибок не вполне корректны и всё не так страшно. Однако, если говорить о медицинских перспективах метода, нужно абсолютно точно представлять, что с его помощью можно редактировать, а что нет, и можно ли довести точность аппарата CRISPR-Cas9 до 100%. Так что если кто-то в связи с CRISPR-Cas9 ждёт появления «дизайнерских детей» или каких-нибудь генетически модифицированных супер-солдат, ждать придётся ещё долго.

Вместе с тем трудно не признать, что с появлением CRISPR-Cas9 наука уже никогда не будет прежней. Мы привели лишь несколько примеров того, как используют CRISPR-Cas9; чтобы кратко перечислить все возможности этого метода, пришлось бы посвятить ему целый журнальный номер. С помощью CRISPR-Cas9 собираются справиться с устойчивыми к лекарствам бактериями, которые стали одной из больших медицинских проблем; с помощью CRISPR-Cas9 создают системы диагностики, в миллионы раз более чувствительные, чем другие диагностические методы; с помощью CRISPR-Cas9 малярийных комаров лишают способности переносить малярию. И даже если до редактирования человека дело так и не дойдёт, CRISPR-Cas9 уже принёс современной науке много полезного.

Среди бактериальных систем CRISPR-Cas есть очень сложные, в которых участвуют сразу несколько белков Cas — например, один ищет нужный участок в ДНК, а другой эту ДНК разрезает. А вот у бактерии Streptococcus pyogenes система CRISPR-Cas оказалась сравнительно простой: её белок Cas9 одновременно удерживает направляющую РНК и сам режет ДНК в том месте, где РНК укажет. Шарпантье и Даудна исследовали систему CRISPR-Cas9 у Streptococcus pyogenes, и для геномного редактора был выбран именно Cas9 как наиболее удобный из Cas-белков. Впрочем, стоит добавить, что сейчас есть варианты редактора CRISPR-Cas, использующие и другие Cas-белки.

Гомологичные хромосомы — это пары хромосом с одинаковым набором генов и одинаковым строением. В паре гомологичных хромосом одна приходит от отца, вторая от матери; и в той, и в другой одни и те же гены расположены в одной и той же последовательности, но варианты этих генов могут быть разные. Например, ген бета-глобина (одного из белков, которые входят в состав гемоглобина) расположен в хромосоме 11, а точнее, в каждой из двух одиннадцатых хромосом, в отцовской и в материнской. Если ген бета-глобина на материнской хромосоме будет повреждён, репарирующие белки исправят повреждения, взяв за образец соответствующий участок на отцовской хромосоме, и наоборот.

Комментарии к статье

* Для простоты будем говорить о ДНК, хотя среди бактериофагов есть и такие, которые хранят свои гены в РНК.

№12, 2020