Вирусы, возможно, сохраняют некоторые черты предшественников жизни на нашей планете. Однако мы знаем их прежде всего как возбудителей опасных заболеваний.

Сергей Евгеньевич Дмитриев. Фото: Пресс-служба МГУ.

Применение метода CRISPR/Cas-скрининга для выявления функций генов. Генетический редактор CRISPR/Cas нужно нацелить на конкретный ген, чтобы он его выключил. Для этого синтезируют множество коротких цепочек нуклеотидов, которые повторяют небольшие фрагменты различных генов-мишеней — они будут служить инструкцией для CRISPR/Cas. Затем их вставляют в геном специальных ретровирусов — они умеют копировать свою РНК в ДНК и вставлять получившуюся ДНК-копию самих себя в геном клетки. Этими вирусами заражают культуру клеток с таким расчётом, чтобы в каждую клетку попала только одна конструкция, нацеленная только на один ген-мишень. Аппарат CRISPR/Cas вместе с вирусным геномом встраивается в клеточную ДНК и отключает этот ген. Отключиться могут гены, которые делают клетку чувствительной к какому-нибудь токсину, и тогда, добавив токсин, мы отберём клетки, которые к нему устойчивы (положительный отбор). Или же это могут быть гены, которые необходимы для повседневной жизни — без них клетки сами погибнут через какое-то время (отрицательный отбор). Какие именно это гены, можно узнать, если достать ДНК из выживших или погибающих клеток и прочесть в их геноме тот участок, куда встроилась нацеливающая «инструкция» редактора CRISPR/Cas. Зная её последовательность, можно определить, какой ген она выключила. Рисунок (с изменениями) из статьи: Xue H., Ji L., Gao A. et al. J. Med. Genet. 2016; 53:91—97.

Аспирант факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ Артём Сергеевич Кущенко за работой в ламинарном боксе.

Структурная модель участка мРНК вируса иммунодефицита человека. Источник: PDB 7lva.

Структурная модель фрагмента IRES-элемента пикорнавируса. Источник: PDB 2nc1.

— Сергей Евгеньевич, чем вызван ваш интерес к теме взаимодействия вирусов с клеткой?

— Вирусы, как известно, не могут жить сами по себе: во внешней среде они выглядят как неживые молекулы, и только попадая внутрь клетки, за счёт её молекулярных систем и ресурсов, они начинают размножаться — делать копии самих себя. Интересно понять, как устроено это взаимодействие между вирусом и «порабощённой» им клеткой хозяина.

Вирусы в этом плане весьма изощрённы. Многие механизмы, имеющиеся у клетки, они умудряются поставить себе на службу, заставляя их работать совсем по-другому. Мне, как молекулярному биологу, это интересно не только с точки зрения вирусологии. Ведь изучая биологию вирусов, мы часто заодно узнаём и о каких-то новых, «экстремальных» аспектах функционирования наших собственных клеток, которые проявляются только при заражении.

— То есть вирусы способны, подобно хакерам, перепрограммировать клетку?

— Именно так. Вирусы применяют много разных хитростей, с помощью которых им удаётся поставить клеточные механизмы себе на службу. Всем этим «трюкам» они «научились» в ходе эволюции. Часть их направлена на то, чтобы заставить белок-синтезирующий аппарат клетки нарабатывать вирусные белки вместо того, чтобы обслуживать нужды хозяина. Это особенно актуально для РНК-содержащих вирусов, которыми мне и моим коллегам приходится заниматься больше всего. Все привыкли, что наследственная информация хранится в ДНК, в нужный момент с неё считываются копии РНК, а с них затем синтезируются белки. Есть вирусы, у которых реализация генетиче-ской информации организована так же, но есть и такие, которые существуют только в виде РНК. Таких вирусов, возможно, даже больше, чем ДНК-содержащих. Считается, что наша жизнь, скорее всего, изначально зародилась именно в виде РНК, и некоторые РНК-вирусы в каком-то смысле, отдельными своими частями, похожи на наших далёких предков. Но все эти миллиарды лет они, разумеется, эволюционировали, подстраивались под всё усложняющиеся формы клеточной жизни и обменивались с клетками генами и регуляторными элементами*.

— Клетка как-то может понять, что в неё проник такой вирус?

— Нормальные клеточные мРНК в процессе синтеза снабжаются некими метками, которые требуются им в последующей «жизни» для эффективной работы и для того, чтобы клетка могла отличить «свои» молекулы РНК от «чужих», вирусных. В качестве этих меток выступают метильные группы и модифицированные нуклеотиды. Если клетка обнаружит чужеродную РНК без этих меток, она должна её уничтожить и включить «сигнал тревоги», чтобы быстро перестроить свою программу для борьбы с патогеном и дать знать окружающим клеткам, что она заражена. Но полностью уничтожить размножающийся вирус внутри клетки довольно сложно. Поэтому, если клетка обнаруживает, что инфицирована, то ей зачастую приходится жертвовать собой во имя спасения всего организма в целом. Обнаружив в цитоплазме РНК без тех самых меток, клетка включает стрессовый ответ, а затем запускает механизм самоубийства и погибает вместе с попавшим в неё патогеном.

— Каким же образом вирусы обходят механизмы клеточной защиты?

— Вирусы стремятся выдать свои РНК за клеточные или воспрепятствовать ответу, который может им всё испортить. Например, у ряда вирусов есть ферменты, которые добавляют похожие метки к вирусным РНК либо воруют кусочки РНК с метками у клеточных транскриптов**. Так делают, например, коронавирусы или вирус гриппа. В других случаях они кодируют специальные белки, препятствующие включению гибельной сигнализации. Это, конечно, лишь немногие из «хитростей», применяемых вирусами.

А вот ещё один пример их изобретательности. Одна из меток, о которых шла речь выше, находится в самом начале мРНК и называется «кэп» — по-английски «шапочка». Это сложная модификация, она появляется у клеточных мРНК ещё во время их синтеза в ядре и нужна, помимо всего прочего, для привлечения рибосомы — большой молекулярной машины, которая и будет синтезировать белок.

Но если вирус размножается в цито-плазме (как многие РНК-содержащие вирусы), то он не имеет доступа к ферментам, синтезирующим кэп. А когда у мРНК нет «шапочки», с неё не только не может синтезироваться белок, но и сама эта РНК быстро деградирует. Однако некоторые вирусы «придумали» такую хитрость: в ходе эволюции они приобрели специальные участки РНК, которые связывают те же самые клеточные компоненты, что и кэп, только делают они это совсем другим, необычным способом. Такие участки есть в РНК пикорнавирусов — к ним относится, например, возбудитель полиомиелита. Особое коварство этого вируса заключается в том, что он ещё и кодирует специальные белки, которые портят ненужную ему часть клеточного кэп-связывающего аппарата. Тем самым он убивает сразу двух зайцев: обеспечивает трансляцию своей мРНК и блокирует синтез клеточных белков. Дополнительный «бонус» — независимость от сигнальных путей, регулирующих активность кэп-зависимой трансляции.

Мы как раз изучаем подобные участки (они называются IRES-элементами) в РНК разных вирусов и пытаемся понять, как им удаётся привлекать рибосому и сажать её не на начало мРНК, как обычно, а на внутреннюю её часть. И загадок здесь хватает.

Вообще-то замена кэпа — это не главное свойство IRES-элементов: среди них есть и такие, которые не привлекают кэп-связывающие белки (например, IRES вируса гепатита С). И наоборот: связывания каких-то компонентов белок-синтезирующего аппарата недостаточно, чтобы посадить рибосому внутрь мРНК. Кроме того, большим и сложно устроенным IRES-элементам (как у пикорнавирусов) для работы зачастую требуются дополнительные клеточные белки, хотя тот же IRES вируса гепатита С, вероятно, обходится без них. Здесь встаёт вопрос о том, почему в случае пикорнавирусов эволюция не пошла по пути максимального упрощения системы: ведь просто устроенные IRES-элементы позволяют вирусным мРНК обходиться меньшим набором клеточных компонентов и могли бы сделать их трансляцию более устойчивой к антивирусным механизмам. Возможно, разгадка кроется в сложных отношениях этих вирусов с организмом-хозяином, где им приходится взаимодействовать с клетками различных органов и тканей.

— Какими методами вы пользуетесь в своих исследованиях?

— Наше кредо — не отказываясь от классических подходов, привнести в эту область самые современные технологии, в том числе методы системной биологии. Один из них — CRISPR/Cas-опосредованный генетический скрининг. CRISPR/Cas — это наиболее эффективный инструмент редактирования генома, за разработку которого в позапрошлом году присуждена Нобелевская премия по химии (см. статью «Редактор для генома», «Наука и жизнь» № 12, 2020 г. — Прим. ред.). С его помощью в том числе можно посмотреть, какие гены нужны для того или иного процесса.

Суть метода CRISPR-скрининга заключается в том, что мы вносим направленные мутации в большую популяцию культивируемых клеток, причём делаем это таким образом, что в каждой из этих клеток выключается какой-то один ген, везде разный, — но мы всегда можем узнать, в какой клетке какой ген был выключен. Потом к клеткам с выключенными генами можно применить какое-либо воздействие, которое в норме их убивает. Например, заразить цитопатическим вирусом. Если какие-то клетки при этом выживут — значит, в них были сломаны гены, необходимые вирусу для заражения или продуктивной инфекции. Такие клетки можно размножить и с помощью секвенирования нового поколения выяснить, какие это были гены.

Сейчас благодаря тесному сотрудничеству с коллегами-вирусологами из Института полиомиелита, Института молекулярной биологии РАН и НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи мы применяем метод CRISPR-скрининга для изучения опасных патогенов человека и животных. Среди них и «модный» сейчас SARS-CoV-2, и возбудитель клещевого энцефалита, и главная наша «любовь» — пикорнавирусы. В группу пикорнавирусов, кроме уже упоминавшегося вируса полиомиелита, входят, например, вирусы Коксаки и эховирусы — они также могут заражать человека, приводя к целому ряду серьёзных заболеваний. Сюда же относится риновирус, из-за которого у нас порой «течёт из носа», и вирус ящура, периодически вызывающий падёж скота. Изучение пикорнавирусов — традиционная для нашего отдела тематика: это главный объект интересов его основателя, члена-корреспондента РАН, профессора Вадима Израилевича Агола. Вадим Израилевич — «живой классик», посвятивший десятки лет исследованиям пикорнавирусов и успешной борьбе с полиомиелитом у нас в стране и за рубежом. Сейчас он принимает активное участие в наших общих проектах.

Метод CRISPR-скрининга уже позволил нам идентифицировать несколько генов, важных для продуктивной пикорнавирусной инфекции. Самая интересная из наших находок — это малоизученный ген, продукт которого, как мы думаем, может быть важен для работы IRES-элементов нескольких эхо- и коксакивирусов. Причём в некоторых случаях он настолько критичен, что его нокаут делает клетки практически неуязвимыми для этих патогенов.

— Могут ли эти исследования привести к разработке новых лекарств?

— Пока мы изучаем фундаментальные аспекты. Но если мы будем знать, продукты каких генов важны для той или иной стадии жизненного цикла вируса, и поймём, как именно они действуют, то впоследствии, опираясь на полученные знания, можно будет создавать принципиально новые высокоспецифичные противовирусные препараты. Таких препаратов до сих пор очень мало (я не говорю о многочисленных «фуфломицинах» — лекарствах с недоказанной эффективностью, которых много на нашем рынке; речь именно о настоящих лекарствах, прошедших серьёзные клинические испытания).

Гораздо чаще при вирусных инфекциях применяют интерфероны и другие вещества, которые помогают повысить неспецифический иммунитет. Они включают те самые «сигналы тревоги», о которых мы говорили выше, но они не направлены против конкретного вируса и поэтому обычно вызывают множество побочных эффектов. Да и для иммунной системы такая постоянная неспецифическая активация тоже не очень полезна. А вот, например, предполагаемое нами взаимодействие белка с IRES-элементом эховируса наверняка высокоспецифично и может стать мишенью для поиска лекарств нового поколения. Это была бы идеальная ситуация: направить атаку не на сам клеточный белок (у такого лекарства было бы много побочных эффектов) и не на вирусные компоненты, а на специфическое взаимодействие вируса с клеточным фактором.

— Но разве не лучше было бы разработать лекарство, направленное непосредственно на белки самого вируса?

— Те немногочисленные препараты, которые направлены на какой-то вирусный белок (протеазу, полимеразу), имеют один принципиальный недостаток: вирусу достаточно лишь немного видоизмениться, мутировать, и он становится устойчивым к такому лекарству.

Проблема лекарственной устойчивости сейчас вообще выходит на первый план в микробиологии. Можно много лет разрабатывать лекарство и потом ещё столько же выводить его на рынок, потратить на это огромные средства — а потом окажется, что за это время уже появились устойчивые к нему штаммы бактерий или вирусов.

Хотя мы и не называем вирусы живыми, но при размножении в клетке на них распространяются те же законы эволюции, что и на всё живое на планете: они мутируют, идёт отбор наиболее приспособленных вариантов. Причём в случае вирусов, как мы недавно убедились на примере SARS-CoV-2, это может происходить с шокирующей быстротой...

— Новая коронавирусная инфекция — она действительно кардинально отличается от всех известных ранее? Вирус быстро мутирует, а мутации крайне разнообразны...

— Ничего принципиально нового здесь нет. Просто до этого (со времён «испанки», наверное) ни один вирус не привлекал столь пристального внимания широкой общественности, а у вирусологов и эпидемиологов никогда не оказывалось такого колоссального объёма данных за столь короткое время. Но были в истории вирусные инфекции и пострашнее. Например, десять лет назад на Ближнем Востоке появился родственный SARS-CoV-2 вирус MERS, от которого скончалось больше трети всех заболевших. К счастью, у него низкая способность передаваться от человека к человеку, поэтому заражённых было немного. А есть ещё вирус лихорадки Эбола, который свирепствует в Африке, — так вот он и вовсе убивает с 50-процентной вероятностью. Если бы такие вирусы распространялись по тому же сценарию, что и SARS-CoV-2, то человечеству, наверное, настал бы конец.

Нынешний коронавирус мутирует как раз относительно медленно, потому что у него есть молекулярные механизмы, позволяющие поддерживать геном в более или менее стабильном состоянии. А вот пикорнавирусы, которые мы изучаем, мутируют с невероятной скоростью. Можно почти без натяжки сказать, что каждая вирусная частица несёт молекулу РНК с одной заменой, то есть каждый новый вирус отличается от своего предшественника одной мутацией. Вместе эти частицы образуют «квазивид» вируса — популяцию с немного различающимися геномами. Человек, который болен этим вирусом, носит внутри себя целый «зоопарк». Стабильность такого «коллективного генома» поддерживается благодаря постоянно действующему отбору: вирусы с мутациями, лишающими их функциональности, не размножаются и выходят из игры.

Это свойство пикорнавирусов делает их серьёзным фактором риска. В любой момент может появиться мутант, который будет вызывать тяжёлые патологии. Например, это может произойти с теми изначально непатогенными вариантами того же полиовируса, которые по-прежнему существует вокруг нас. Люди с ослабленным иммунитетом могут, сами о том не подозревая, становиться инкубаторами для появления новых штаммов. Вот почему от полиомиелита надо обязательно вакцинироваться (как, впрочем, и от других инфекционных болезней, против которых есть качественные вакцины). Вообще, если бы вирус, способный вызвать пандемию, получился из пикорнавируса, а не из коронавируса, из-за высокой скорости мутаций ситуация могла бы стать неуправляемой.

Так что, несмотря на невосполнимые потери, коронавирусная пандемия всё же едва ли положит конец нашей цивилизации. Но поскольку это точно не последняя вирусная эпидемия, мы должны вести себя разумно, вовремя вакцинироваться. И почаще прислушиваться к мнению учёных.

Комментарии к статье

* Регуляторными элементами называют некодирующие последовательности в ДНК или РНК, влияющие на активность генов.

** Транскрипцией называют синтез РНК-копии на участке ДНК, транскрипт — РНК, получившаяся в результате транскрипции.

Статьи по теме

• Синтез белка — с «шапкой» и без «шапки»

№5, 2022