РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ
В. СОЙФЕР, КАНД. БИОЛ. НАУК
Исследования в области регуляции генетической активности стали одной из самых замечательных глав молекулярной генетики. Менее десятилетия понадобилось для того, чтобы доказать справедливость гипотезы французских ученых Ф. Жакоба и Ж. Моно о существовании в клетках живых организмов сложной иерархии генов.
Кандидат биологических наук В. СОЙФЕР.
Основная задача генов, как теперь хорошо известно генетикам, заключается в программировании синтеза белков живой клетки. В соответствии с генетической программой аминокислоты выстраиваются чередой в молекулах строящихся белков - в этом главная цель, и основной смысл наследственной записи.
Возникнет изменение в наследственной записи, мутация, как говорят генетики, - и это изменение закрепится в строении молекул белков, синтезируемых под контролем измененного гена.
Если это изменение приведет к образованию белка, лучше справляющегося со своими обязанностями, организм с «хорошим» белком получит шансы на лучшее существование, более быстрое размножение; его потомки тоже будут отличаться этим признаком ведь наследственная запись исчезнуть не может, она же наследственная, передающаяся по поколениям.
Благодаря «хорошей» мутации измененный организм, и его потомки закрепятся в природе, а затем, согласно дарвиновскому естественному отбору, займут свое место в ней. В своей эволюции жизнь сделает еще один шаг или шажок (в зависимости от веса того приобретения, которое принесет «хорошая» мутация).
Нетрудно представить себе последствия и вредной мутации. Организмы, несущие эти признаки, не выдержат конкуренции, и погибнут, освободив место для более приспособленных особей.
Так в один узел оказываются связанными свойства двух важнейших структур живых клеток - нуклеиновых кислот и белков, и особенности протекания двух важнейших процессов живых существ - наследственности и изменчивости. А без осуществления обоих процессов нельзя себе представить другого важнейшего свойства живой материи - эволюции живых существ.
Цепь экспериментальных доказательств, приведших к установлению этих закономерностей, была длинной, но полученный вывод оказался прост, и доступен.
В соответствии с записанной в генах информацией, в них синтезируются полипептидные (белковые) цепи - каждому гену соответствует своя цепь. Если возникает мутация, то есть изменение структуры гена, то эта мутация изменит строение молекул белков (опять-таки важно подчеркнуть, что только тех белков, которые синтезировались под контролем измененного гена).
Эта схема была надежно подтверждена экспериментально. Многие гены, особенно у микроорганизмов, которые стали наиболее популярными объектами изысканий генетиков, были не только описаны, но и картированы. Говоря проще, генетики установили место расположения этих генов в наследственных структурах - хромосомах. Более того, белки, синтезируемые под контролем этих генов, были хорошо изучены.
И вот в строю надежно подтвержденных и. главное, хорошо понятых фактов был найден пример, который ломал всю привычную для генетиков картину.
В 1961 году два французских ученых, сотрудники знаменитого Пастеровского института в Париже, нашли несколько мутаций, которые влияли не на один фермент, а сразу на несколько ферментов. Ученые тщательно изучили явление, и твердо убедились в том, что их мутации были действительно точечными *, действительно единичными, и тем не менее они влияли на синтез не одного, какого-то белка, а сразу на серию таких белков.
Этот факт требовал либо отказаться от привычного положения «один ген одна полипептидная цепь», либо надо было искать новое объяснение природы этих мутаций.
И это новое объяснение было найдено французскими учеными. Они смогли примирить между собой все стройное построение генетических теорий, созданное до них, и новые факты, которые, как поначалу казалось, противоречат этим теориям.
Прежде чем рассказать о теории Ф Жакоба и Ж. Моно (а спустя девять лет мы можем смело называть гипотезу Жакоба и Моно теорией), нам надо еще несколько слов сказать о тех белках, о которых шла речь выше.
В составе живых клеток любых организмов можно встретить разные типы белков транспортные белки, которые переносят молекулы или атомы в нужные места клеток строительные белки, которые входят в состав различных клеточных структур и органелл; ферментные белки, самые широко распространенные, и разнообразные, которые управляют всеми реакциями в клетке. Активность именно ферментных белков позволяет клеткам жить. Без их работы клетки оставались бы практически мертвыми ведь скорость любых химических реакций без помощи этих катализаторов была бы в миллионы раз меньше, чем реальная скорость химических превращений в живых клетках. Именно ферменты вдыхают жизнь в безжизненные в их отсутствие клеточные структуры.
Синтезом ферментов, как и всех остальных белков, управляют гены. Поэтому первоначально афоризм, пояснявший роль генов, гласил «Один ген - один фермент». Именно так определили ген авторы афоризма Джордж Билл, и Эдвард Тэтум в 1941 году. И лишь позднее, когда химики установили, что нередко один ферментный белок состоит из нескольких субъединиц, а каждая субъединица представлена отдельной цепью аминокислот (полипептидной цепью), стали говорить «Один ген - одна полипептидная цепь», - подчеркивая, что под контролем одного гена синтезируется одна такая цепь.
Чтобы идти дальше, поясним эту связь на примере ферментов, управляющих в клетках усвоением одного из сахаров - лактозы (кстати, именно эту систему ферментов исследовали Жакоб и Моно).
Было установлено, что в состав лактозной системы входят три фермента, и соответственно этому три гена. Ферментам бета-галактозидазе, транс-ацетилазе и галактозид-пермеазе соответствовали гены, обозначенные буквами z, у, и а. С помощью этих ферментов молекулы молочного сахара - лактозы - протаскивались внутрь клетки и там расщеплялись до таких компонентов, которые легко усваивались клетками.
Нередко среди других мутаций возникали, и такие, которые нарушали активность одного из генов лактозной системы, и тогда синтез фермента, соответствовавшего этому гену, прекращался. Но однажды Жакоб и Моно обнаружили мутацию, от которой прервался синтез сразу всех трех ферментов, входящих в лактозную систему.
Еще более неожиданная находка поразила ученых в другой раз. Синтез сразу -всех трех ферментов под влиянием мутации начал идти с гораздо большей скоростью, чем раньше. В последнем случае ученые обнаружили и третью особенность. Обычно синтез ферментов в клетках шел только тогда, когда к клеткам добавляли лактозу. Как только источник этого сахара иссякал, прекращался, и синтез ферментов *. Складывалось впечатление, что клетка обладает способностью регулировать активность генов. (Вот мы и употребили впервые выражение, которое должно стать лейтмотивом статьи, - регуляция генной активности)
Наличие именно этого свойства в живых клетках предположили Жакоб и Моно.
С этих позиций обнаруженный учеными тип мутаций, в результате которого синтез ферментов шел с высокой неуправляемой скоростью, можно было объяснить тем, что при этой мутации регуляторная способность клеток нарушалась и начинался нерегулируемый синтез ферментов.
Мы подошли к самой сути предположений Ф. Жакоба и Ж. Моно.
Итак, мутации, которые они обнаружили, затрагивали активность сразу всех трех генов лактозной системы - происходило или координированное выключение всей системы (и тут уж добавляй не добавляй сахара к клеткам, синтез ферментов не начинался), или же безостановочное функционирование системы (ферменты синтезировались вне зависимости от того, есть сахар во внеклеточной среде или его нет). Но, чтобы объяснить этот факт, надо было прежде всего локализовать эти мутации. обнаружить их местоположение. И с помощью генетических методов ученые сделали это. Они показали, что мутации расположены в стороне от генов лактозной системы - z, у, и а; установили, что они точечные, то есть, что это не совпадение сразу трех отдельных мутаций, возникших независимо в каждом из генов.
Естественно было бы предположить, что ученые нашли такие участки хромосом, где, по-видимому, располагалась регуляторная область генной активности. Мутации этих участков нарушали нормальную активность регуляторной области, после чего, и начинались чудеса в работе лактозной системы.
Так было выдвинуто предположение о существовании в клетках двух типов генов обычных генов, которые управляли
* Сам по себе этот факт был загадочным. Ведь генетики всегда полагали, что раз гены существуют в хромосомах, то и активность их должна проявляться. Поэтому ферменты должны были всегда присутствовать в клетках, если генетические структуры этих клеток несли нужные гены. синтезом специфических ферментов, и тех генов, которые управляли работой первых. Поскольку первые гены определяли структуру синтезируемых ферментов, их назвали структурными генами, вторые гены - регуляторными.
Предположение о существовании регуляторных генов было только началом. Нужно было показать, как работают, как функционируют эти гены. Жакоб и Моно посягнули, и на это. Они разделили функцию участков регулирующих систем. Их логическая схема хорошо подтверждалась опытами
Получалось так, что в регулирующей системе генов есть участки, которые находились в непосредственной близости от структурных генов. Они выполняли роль выключателей в осветительной электрической системе замкнешь выключатель - свет горит, разомкнешь - свет выключается. Так и эта ячейка регуляторной системы - ее назвали оператором - определяла состояние генов структурных. При включенном операторе гены управляли синтезом специфических ферментов, при выключенном - синтез ферментов прекращался.
Но, подобно тому, как выключатель не может сам замыкаться или размыкаться, нужен кто-то или, что-то, что управляло бы работой выключателя, так, и для оператора нужно было искать его «управляющего»
Жакоб и Моно предположили, что таким управляющим мог быть особый ген регулирующей системы - ген регулятор. Он мог располагаться вдали от блока структурных генов, и примыкавшего к ним оператора, и задача гена-регулятора заключалась в синтезе особого агента-репрессора. Именно репрессор, по мысли Жакоба и Моно, мог взаимодействовать с оператором и включать или выключать его. И тогда структурные гены начинали или прекращали свою работу.
Последним важным моментом в схеме Жакоба и Моно было предположение о том, как можно отсоединить от оператора «прилипший» к нему репрессор. Наличие такого «отсоединяющего» механизма было очевидно. Если бы репрессор мог присоединяться к оператору, но не было бы способа его отсоединения, структурные гены навечно оставались бы закрытыми для функционирования.
Ключом для разгадки послужило следующее наблюдение синтез нужных ферментов в больших количествах наблюдался в том случае, когда, например, к клеткам добавлялось нужное вещество, скажем, молочный сахар. Значит, сам сахар, продукт его распада или близкая ему по строению молекула могли присоединиться к репрессору и помочь ему оторваться от хромосомы.
Это вещество, помогающее репрессору освободиться, было названо индуктором. Авторы предположили, что, когда индуктор присоединяется к репрессору, форма молекулы репрессора меняется, и он сам отваливается от хромосомы.
Итак, теперь вся схема Жакоба и Моно нам известна (см. рис.).
Повторяю, эта схема достаточно надежно была подтверждена опытами Жакоба и Моно на бактериях кишечной палочки. Были найдены места расположения всех элементов регуляторной системы на хромосомах, получены их мутации и изучено их поведение.
Но одно оставалось совершенно неизвестным, что же собой представляют молекулы репрессоров? То ли это белковые молекулы? То ли молекулы рибонуклеиновых кислот? То ли смесь, и того и другого?
С 1961 года, года рождения регуляторной гипотезы Жакоба и Моно, и до 1967 года, года установления химической природы репрессора, споры о его природе не утихали. Появлялись данные, как в пользу первой, так, и других версий.
Давайте разберемся в свойствах репрессорных молекул. Два основных свойства должны отличать эти молекулы. Во-первых, они должны уметь узнавать определенные участки на молекулах дезоксирибонуклеиновых кислот, входящих в состав хромосом, участки операторов. Во-вторых, иметь участки, которые бы узнавались молекулами индукторов.
Итак, в молекулах репрессоров должно быть два активных центра один для ДНК и одни для продуктов распада сахара. Исходя из этого, довольно логичным казалось предположение о двойственной природе репрессорных молекул. Следовало допустить, что они содержат, и РНК и белок. Но тем не менее точные эксперименты доказали лишь белковую природу репрессоров. По крайней мере для двух систем генов.
Почти одновременно (летом 1965 года) сразу в двух лабораториях начались эксперименты по выделению репрессоров. В Гарвардском университете Бенно Мюллер-Хилл, стипендиат из Западной Германии, и Вальтер Гильберт, сотрудник Гарвардского университета, начали опыты с кишечной палочкой.
Примерно в это же время в том же Гарвардском университете Марк Пташне, только, что окончивший колледж, начал работу в лаборатории всемирно известного Джеймса Уотсона, того Уотсона, который вместе с Фрэнсисом Криком открыл структуру ДНК и получил за это Нобелевскую премию.
Обе исследовательские группы начинали работу на свой страх, и риск. Они абсолютно не были уверены в успехе своих поисков, более того стоявшие перед ними «проблемы были, как научными, так и философскими. Мы не знали, - писали Пташне, и Гильберт недавно, - искать ли репрессоры среди белков, нуклеиновых кислот или других веществ так, как не было известно путей для проверки функций репрессоров, то мы могли высказать догадки о некоторых других их свойствах, которые дали бы нам точку опоры, но пока не было сделано совершенно убедительных экспериментов, мы не знали, верны ли наши рабочие гипотезы. По сути дела, мы не были уверены, что опыты могут привести вообще к, какому-нибудь исходу»
В чем же состояли основные приемы, использованные одной и другой исследовательской группой? Эти приемы сильно различались, и мы начнем с работ группы Мюллер-Хилла - Гильберта.
Как уже сказано, два основных свойства характеризуют молекулы репрессоров - их сродство к ДНК и к индукторам. Молекулы индукторов - продукты распада сахаров или близкие к сахарам соединения - отличаются довольно малым молекулярным весом, а значит, и малым размером, во всяком случае, много меньшим, чем размеры белков и нуклеиновых кислот.
Этим воспользовались исследователи. Они пометили молекулы индукторов радиоактивными атомами. Замена части атомов на радиоактивные позволяла легко следить за концентрацией индукторов если индукторы могут присоединяться к молекулам репрессоров, то, и надо предоставить им эту возможность, а затем постараться разделить клетки на составляющие и в той части, в которой окажутся сосредоточенными меченые индукторы, провести детальный химический анализ.
Авторы работы взяли специально приготовленный целлюлозный мешочек, через тонкие поры которого легко проходили молекулы индукторов, но не могли проникать ни молекулы белков, ни молекулы нуклеиновых кислот, и поместили внутрь мешка концентрированную суспензию бактерий кишечных палочек.
Мешочек завязали, опустили в воду, затем добавили в воду нужную порцию радиоактивных индукторов По законам диффузии индукторы должны были бы распределиться равномерно и в среде, окружающей мешочек, и в самом мешочке. Однако в том случае, если индукторы связывались бы с репрессорами, тогда они должны были бы накопиться внутри мешка. Именно так и произошло в опыте. Мешочек оказался буквально набитым индукторами. После разрушения бактериальных клеток, и фракционирования содержимого удалось показать, что индукторы связались с белковыми молекулами, а не с, какими-либо другими веществами клетки.
Второй опыт Мюллер-Хилла и Гильберта был не менее показателен. В нем участвовали бактерии, мутантные по синтезу репрессора. (Вначале мы упоминали о том, что еще Жакоб и Моно нашли мутантные клетки, в которых репрессор, по их представлениям, отсутствовал, и это приводило к нерегулируемому синтезу ферментов лактозной системы.) Идея эксперимента сводилась к следующему. Если в этих клетках нет репрессоров, то связываться индуктору будет не с чем. Тогда не произойдет никакого накопления индукторов внутри клеток. Этот результат, и был зарегистрирован. Таким образом, второй раз, уже от противного, была доказана белковая природа репрессора.
Несмотря на внешнюю простоту метода, исследователям пришлось столкнуться с многими трудностями, и только спустя девять месяцев работа была закончена.
Принципиально тот же метод накопления репрессора, но технически совершенно иначе выполненный, был применен Марком Пташне. Он работал с бактериофагом лямбда, заражавшим клетки бактерий кишечной палочки. При заражении клеток этим фагом могли происходить два события либо фаг начинал активно размножаться, и в конце концов потомки фага разрушали бактериальные клетки, либо фаговые хромосомы присоединялись к бактериальной хромосоме и начинали размножаться вместе с ней, но, и при этом уже никакого разрушения бактерий не происходило.
Переход из одного состояния в другое шел под контролем специального фагового репрессора, который так и называли «лямбда-репрессором»
Пташне, так же, как Мюллер-Хилл, и Гильберт, пытался прежде всего определить природу молекул репрессора, а затем уже выяснить механизм его работы. Чтобы пояснить, какие трудности сопровождали работу по накоплению репрессоров, отметим, что в среднем на одну бактерию Е. coli приходится около 10 - 12 молекул репрессорных белков, что составляет лишь 0,00002 долю от всех белков клетки кишечной палочки.
Идеальным способом накопления репрессорных белков фага лямбда в бактериях был бы, конечно, такой, при котором удалось бы добиться подавления синтеза всех белков - и клеточных, и фаговых, кроме одного репрессорного белка.
Пытаясь реализовать эту задачу, Пташне облучил большой дозой ультрафиолетового света бактериальные клетки. При этом все. внутриклеточные синтезы белков самой клетки приостанавливались, но синтезирующий аппарат клетки (клеточные фабрики белков) остался нетронутым, и при заражении этих клеток фагом его белки синтезировались на клеточных синтезирующих машинах нормально. Тем самым полдела было сделано синтез клеточных белков приостановлен.
Но оставалась вторая задача - устранить синтез всех фаговых белков, кроме репрессорных. Этого Марк Пташне отчасти добился. Он использовал такие бактерии, в которых хромосомы самой бактерии (кишечной палочки) уже были связаны с участком хромосомы фага лямбда. Причем опыт был поставлен так, что в этом участке хромосомы содержался ген, препятствующий размножению самого фага, но не мешающий синтезу фагового репрессора.
Разработав подобную методику, Пташне надеялся достигнуть накопления молекул фагового репрессора. Но надежды эти не оправдались. Количество синтезированных в этих условиях белков упало во много раз, а синтез репрессорных белков все равно составил лишь 5 - 10 процентов от остаточного синтеза всех белков. Стало ясно, что таким путем добиться накопления в ощутимых количествах репрессора фагов лямбда не удастся.
Тогда Пташне решил объединить свой метод с методом радиоактивных изотопов так же, как, и раньше, фагом заражались инактивированные ультрафиолетовым светом бактерии, но перед заражением облученные клетки делили на две порции. К одной порции добавляли фаг с нормальным геном для репрессорных белков. Одновременно с этим к зараженным клеткам добавляли меченые по радиоактивному изотопу водорода (тритию) аминокислоты. Таким образом, все белки, которые синтезировались в этих клетках (и среди них до 10 процентов репрессорные белки), бы хи радиоактивными.
Другую порцию клеток заражали фагом, у которого ген для белка-репрессора был испорчен мутацией. К этим клеткам добавляли аминокислоты, меченные по радиоактивному изотопу углерода. С помощью сцинтилляционных счетчиков можно было успешно отличить радиоактивное излучение (бета-излучение) углерода – С14 от излучения трития – H3.
После того, как синтез фаговых белков в обоих типах клеток закончился, М. Пташне разрушил клетки, смешал вместе их содержимое, а затем нанес на верх хроматографической колонки, позволявшей разделить разные белки. Результат этого разделения белков можно было прежде всего проверить по радиоактивности. И тритиевая, и углеродная радиоактивность почти полностью совпали. И лишь только в одном месте хроматографической колонки собрались белковые молекулы, радиоактивность которых резко отличалась. Пик радиоактивности, обнаруженный в этом участке колонки, принадлежал тритию. Иначе говоря, в этом месте собрались белки, которых не было в бактериях с мутантным репрессорным геном. Автор работы резонно предположил, что в этом месте сконцентрировались репрессорные белки фага лямбда. Дальнейшая проверка подтвердила это предположение.
Так Пташне удалось выделить, и одновременно очистить репрессорные молекулы фа-ia лямбда. Кроме того, в этом опыте он строго доказал белковую природу репрессора ведь радиоактивные предшественники молекул репрессоров, которые помогли ему обнаружить репрессорные молекулы, были аминокислотами. Значит, синтезированный из них продукт не мог быть не чем иным, кроме, как белком.
Научившись концентрировать в достаточных количествах молекулы репрессорных белков, ученые смогли изучить их химические и физические свойства. Оказалось, что при нейтральном значении pH среды они обладают слабым отрицательным зарядом. Выяснилось, что молекулярный вес этих белков довольно большой 38 тысяч для лак-репрессора, и 28 тысяч для лямбда-репрессора.
Винсенто Пиротта, молодой сотрудник лаборатории М. Пташне, недавно обнаружил, что молекула лямбдового репрессора состоит из четырех субъединиц, четырех полипептидных цепей. Молекулы обоих репрессоров не содержат никаких дополнительных привесков и представляют собой чистые белки.
Исследования в области регуляции генетической активности стали одной из самых замечательных глав молекулярной генетики. Менее десятилетия понадобилось для того, чтобы доказать справедливость гипотезы Жакоба и Моно о существовании в клетках живых организмов сложной иерархии генов, о наличии в них генов-работников и генов-управляющих.
Читайте в любое время
