НОВОЕ ДОСТИЖЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ВЫДЕЛЕН ЧИСТЫЙ ГЕН ИЗ ЖИВЫХ МОЛЕКУЛ ДНК
В. СОЙФЕР, КАНД БИОЛ. НАУК
Те, кто следит за достижениями молекулярной биологии, должно быть, уже привыкли, что в этой молодой науке, вступившей всего лишь в третье десятилетие своего существования, крупные открытия совершаются часто, даже очень часто. Всего лишь 17 лет назад американец Джеймс Уотсон, и англичанин Фрэнсис Крик предложили гипотезу о строении молекулы ДНК, которая, по их мнению, не разделявшемуся, впрочем, в то время большинством биологов, являлась хранителем генетической информации. Очень скоро, прямо-таки в фантастически сжатые сроки, мнение Уотсона, и Крика о том, что ДНК действительно несет запись о всех генах организма, было доказано экспериментально. К началу шестидесятых годов стало ясно, что генетическая информация с молекул ДНК передается на похожие на них по своей структуре молекулы РНК. Последние соединяются с особыми структурами клетки - рибосомами, в которых, и происходит синтез белка. Немногим ранее Г. Гамов (США), Ф. Крик, и другие создали логически завершенную модель генетического кода. Самое важное заключалось в том, что было строго указано, для чего клетке нужна генетическая информация (синтез специфических белков, которые, и определяют свойство жизни, и возможность осуществления многообразных жизненных функций). Было показано, и, как отдельные элементы молекулы ДНК (по мысли Гамова, с которой все согласились, тройки нуклеотидов, расположенные вдоль цепи ДНК) кодируют строение синтезируемых в рибосомах белков.
Мало кто ожидал - даже среди весьма проницательных генетиков, - что уже в 1961 году Крик, и его три помощника «расправятся» с задачей об общей природе генетического кода. Правда, путь к расшифровке состава отдельных троек, кодирующих аминокислоты, был открыт работой М. Ниренберга, и Д. Маттеи, доложенной в Москве летом того же 1961 года. И уж совсем трудно было предполагать, что всего через два с половиной года американцы М. Ниренберг и Ф. Аедер предложат способ, позволяющий выяснить точное строение всех 64 кодовых слов генов. Уже через год генетики знали наследственный алфавит природы.
Но решение этих задач не увеличивало наших знаний о точном строении гена, точном строении молекул отдельных информационных, и транспортных РНК. В 1964 1965 годах Холли в США, и А. Баев в СССР расшифровали первые, самые маленькие из молекул, обслуживающих генетические таинства, - молекулы транспортных РНК. В 1967 году в лаборатории А. Корнберга в США после многолетних безуспешных попыток удалось синтезировать работоспособную молекулу ДНК фага 0X174. Через год Г. Корана (индиец, переехавший в США) в хитроумном эксперименте сумел синтезировать первый ген для транспортной РНК дрожжей. И вот сейчас, всего через год, выделен чистый ген из живых молекул ДНК!
В номере английского журнала «Нейчур» от 22 ноября 1969 года опубликована статья шести сотрудников Гарвардской медицинской школы Джона Беквита, Джима Шапиро, Лорне Макхатти, Лэрри Эрона, Гэррет Ихлер, и Карины Иннен. В статье приводятся данные о выделении отдельного гена из ДНК кишечной палочки, и приводится его электронная микрофотография (вверху).
Как ни парадоксально, этот грандиозный по своему замыслу, выполнению, и последствиям для науки эксперимент не был самоцелью. Беквит, широко известный специалист в области молекулярных основ реализации генетической информации, в предисловии указывает на главную цель, которую он, и его коллеги преследовали, начиная работу. Им было важно найти ключи к разрешению давнего спора о том, когда происходит регуляция генной активности. Имелись две противоположные точки зрения.
Согласно первой, сам ген (то есть участок ДНК со строго определенной последовательностью нуклеотидов) может быть ареной регуляции. В таком случае с активированных генов будет списываться информационная РНК, а с репрессированных 1енов такого списывания происходить не будет.
Согласно второй точке зрения, информационные РНК всегда синтезируются одинаково, но они могут считываться или не считываться в рибосомах, и тогда белки либо будут синтезироваться, либо не будут. Для неспециалиста этот спор может показаться строго академическим. На самом деле от разрешения этого вопроса зависят практически все дальнейшие успехи молекулярной генетики в овладении тайнами жизни не только клеток, но, и многоклеточных организмов. Не могут быть достигнуты без решения этого спора, и практические достижения по управлению жизнью клетки.
Чтобы подобраться к решению проблемы, Беквит решил получить отдельный ген, и заставить его работать в искусственных условиях начать синтезировать РНК, затем белок, и узнать на этой искусственной модели, где же происходит регуляция генной активности.
Рассказать все тонкости эксперимента по добыванию гена, пожалуй, будет трудно, поэтому лучше остановиться только на самых основных этапах опыта.
Еще лет пятнадцать тому назад французские ученые Л. Львов, Ф. Жакоб, и И. Вольман изучили процесс так называемой лизогенизации бактериальных клеток уморенными фагами. Попробуем расшифровать смысл этого набора слов, с первого взгляда, кажущегося абракадаброй.
Что такое фаги, или бактериофаги (слово «бактериофаг» буквально означает «пожирающий бактерии»), сегодня хорошо известно большинству читателей. Они были открыты в 1915 году Ф. Туортом, и с тех пор стали, пожалуй, существами, наиболее хорошо изученными биологами. Их условно разделили на два типа - вирулентные, и умеренные. Первые, нападая на клетку, разрушают ее. Умеренные фаги тоже чаще всего просто разрушают бактерии, но иногда их поведение меняется.
Устройство любых вирусов примитивно. Сверху они покрыты белковой оболочкой. Внутри этой своеобразной белковой шубы находится спиралька нуклеиновой кислоты, в которой записано сочетанием троек нуклеотидов все, что необходимо знать, и уметь вирусной частице.
Именно нуклеиновая кислота (ДНК или у ряда вирусов РНК), попадая внутрь клетки, дает команду для постройки требуемого количества копий ДНК первой вирусной частицы, и белковых молекул. Когда строительство вирусных частиц закончится, они разрушат бактериальную клетку, выйдут наружу и нападут на соседние бактерии.
Это, так сказать, обычный ход процесса. Иногда тактика убийц меняется коренным образом. Молекула нуклеиновой кислоты вируса проникает внутрь бактерии, но не размножается, а просто присоединяется к нуклеиновой кислоте бактерии, и начинает размножаться вместе с ней. Вирус, как бы исчезает. Убийца спрятался внутри, лизогенизировал клетки, как говорят ученые. (Слово «лизогенная» расшифровывается просто лизис значит растворение, разрушение; ген означает рождающий). Такая бактерия разрушит себя, и выпустит вирус на ружу. Сам же вирус, закрепившийся внутри клетки, получил название «провирус»
В 1950 году А. Львов, и Л. Симинович, не отрываясь от микроскопа несколько суток, следили за потомками одной-единственной клетки бактерии. Ученые знали, что клетка лизогенца. Проходило одно деление за другим, но вирус, пли, вернее, провирус, кичем себя не проявлял. Наблюдение длительное время было безрезультатным. И, наконец, когда ученые уже хотели прекратить опыт, произошло то, чего они ждали. Одна из клеток лопнула. Провирус прекратил свое потаенное житье, отсоединился от ДНК бактерии, и вышел наружу.
Потом Ф. Жакобу, и И. Вольману удалось выяснить, что, облучив клетки ультрафиолетовыми лучами или обработав их некоторыми химикалиями, можно искусственно понудить провирус к размножению.
При лизировании клеток провирус может иногда «прихватить» с собой один или несколько генов от ДНК бактерии. А так, как многие пре вирусы присоединялись к ДНК бактерии не в любом случайном месте, а в строго определенном, то определенные провирусы выхватывали вполне определенные гены из бактериальной хромосомы (молекулу ДНК бактерий или фагов по аналошп с высшими организмами принято называзь хромосомой).
Эго наблюдение, сделанное еще в 1951 году американцами супругами Ледербе.рг, и Нортоном Зиидером, и было использовало Беквитом, и его коллегами.
Беквит использовал два умеренных фага 7 и 0 80. В 1966 году было выяснено, что эти фаги прикрепляются по обе стороны от участка хромосомы бактерия, содержащего гены лактозной системы. При лизировании эти фаги отрывают от ДПК участки примерно равной длины. Главное же заключается в том, что оба фага отрывают один, и тот же участок, по с разных сторон.
Узнав об этой удивительной способности фагов, Беквит, и ею сотрудники, по сути дела, получили все, что им было нужно для выделения индивидуального гена. Если бы фаги вырвали один, и тот же ген из родственных бактерий, исследователи получили бы две копии этого гена.
Для того, чтобы узнать, действительно ли это точные копии генов, авторы воспользовались вторым важным методом - так называемым методом молекулярной гибридизации.
ДНК, как правило, состоит из двух закрученных друг вокруг Друга однонитевых полинуклеотидных нитей. Каждая нить содержит много повторяющихся нуклеотидов аденинового, гуанилового, цитидилового, и тимидилового. Существует правило против аденина в одной нити может встать только тимин в другой, и соответственно против гуанина - цитозин. Поэтому если в одной нити чередование нуклеотидов, к примеру, такое:
ГТААЦГАТЦА,
то вторая нить будет иметь такой вид:
ЦАТТГЦТАГТ.
Если правило не соблюдается, молекула распадется на отдельные нити.
Но ученые выяснили, что можно добиться расхождения на составляющие нити, и вполне нормальной двунитевой ДНК, если нагреть ее до температуры около 90 С или если подействовать на нее щелочью. Эти однонитевые молекулы можно вновь соединить, гибридизировать, как говорят генетики, если смесь медленно охлаждать или нейтрализовать щелочь. Самое удивительное, и важное в этом процессе заключается в том, что при гибридизации одинаковых молекул или, вернее, молекул, содержащих одинаковые участки, происходит точное воссоединение структуры ДНК. Участки, в которых пет родства, остаются свободными.
Итак, Беквит, и сотрудники, использовав фаги, вырвали из бактериальной хромосомы участок. Затем нити ДНК обоих фагов, и присоединенных к ним фрагментов хромосомы были расплавлены, а затем, не дав им гибридизировать между собой, были помещены в ультрацентрифугу. Поскольку вес, и состав одной, и другой нити неидентичен, их можно разделить. Это, и было сделано. Авторы взяли только те нити, которые были зеркально подобны друг другу (комплементарны). Одна нить была от одного фага, а другая - от другого. Эти нити гибридизировали. При этом гибрид образовался только в том месте, где располагались одинаковые последовательности нуклеотидов. Очевидно, что такое подобие, или комплементарность, наблюдалось лишь в участке лактозного гена, а остальные участки остались однонитевыми. Использовав специальный фермент, который разрушает эти однонитевые участки, но не может разрушить двунитевой участок, авторы «откусили» однонитевые хвосты, и получили чистый ген.
Этот фрагмент ДПК, содержащий около 4 700 пар нуклеотидов, был рассмотрен в электронном микроскопе. Его длина оказалась равной 0,0014 - 0,0015 миллимикрона.
Работа Джона Боксита, и его сотрудников вызвала невиданный интерес в мире. Авторы догадывались о возможных спорах, и на первой странице своей работы они поместили коротенькое уведомление «Авторы просят не присылать запросов на отдельные оттиски их работы, а направлять запросы непосредственно в редакцию журнала «Нейчур»
Но запросы запросами, а разговоров, и кривотолков вокруг работы множество. Газеты, как бы щеголяют друг перед другом лихостью своих предположений работа будет иметь огромное медицинское значение, работа будет иметь колоссальное военное значение, и т. д., и т. п.
Сами авторы предельно строги, и лаконичны. Они видят пока лишь один смысл в полученных ими результатах возможно, что способ получения индивидуальных генов позволит разобраться в том, как осуществляется регуляция генной активности. Подождем, и мы дальнейших исследований в этом направлении. Тем более, что Беквит извещает в статье, что уже имеется продолжение работы, и оно уже отправлено в печать. В нем речь пойдет о том, как работает индивидуальный ген.
Читайте в любое время
