Новый метод позволяет наблюдать за молекулярной кухней митохондрий, не разрушая их.

Энергию, чтобы жить, мы получаем из еды. Но сами по себе белки, жиры и углеводы для нас бесполезны – энергию, заключённую в их химических связях, нужно перевести в другую, более доступную форму, чтобы клетка могла её использовать. Для этого в клетке существуют специальные органеллы – митохондрии: любая молекула, предназначенная для извлечения из неё энергии, заканчивает свой путь здесь (хотя уточним, что митохондриальному этапу предшествует множество других биохимических реакций, преобразовывающих «питательный субстрат» до удобного для митохондрий вида).

Раскрашенная электронная микрофотография митохондрий клетки лёгкого, внутри которых видны складки (кристы), образованные внутренней мембраной. (Фото: Louisa Howard / Wikipedia)

Наноструктурированная серебряная поверхность под сканирующим электронным микроскопом. (Фото Brazhe, N. A. et al. Probing cytochrome c in living mitochondria with surface-enhanced Raman spectroscopy. Sci. Rep. 5, 13793; doi: 10.1038/srep13793 (2015).)

Энергия добывается с помощью кислорода, то есть происходит окисление: электроны отрываются от «пищевой молекулы» и передаются кислороду, который присоединяет два водорода (в виде ионов протонов) и превращается в молекулу воды. Но электрон приходит к кислороду не сам по себе, а по сложной электрон-транспортной цепи. Она представляет собой несколько белковых комплексов, сидящих во внутренней мембране митохондрий. (Внешняя мембрана отделяет митохондрии от окружающей её цитоплазмы, внутренняя делит митохондриальный объём на две части для удобства проведения биохимических реакций.) Белки цепи передают друг другу электрон, пока последний из них не отправит его на кислород. В подробности мы углубляться не будем, скажем лишь, что в результате энергия, высвободившаяся при окислении питательных веществ, запасается в молекуле АТФ – в таком виде энергию очень легко использовать в самых разных реакциях.

Учитывая фундаментальную роль, которую играют митохондрии в жизни клетки, не стоит удивляться тому интересу, который к ним испытывают биологи. И, хотя структура электрон-транспортной цепи понятна нам не только в общем, но и во многих деталях, здесь остаётся ещё достаточно белых пятен. В частности, есть много что исследовать в поведении образующих её белков, в частности, цитохрома С. Так называют одного из важных электронных переносчиков: цитохром С всё время бегает по поверхности внутренней митохондриальной мембраны, беря электрон у одного белкового комплекса и отдавая его другому. Что конкретно происходит между митохондриальными мембранами и с самим цитохромом С при переносе электронов? На этот вопрос можно было бы ответить с помощью метода так называемой гигантской или поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии (также SERS – surface-enhanced Raman spectroscopy или спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния).

Свет, который, как мы знаем, есть поток фотонов, падая на какой-то предмет, меняет свои характеристики, в частности, частоту колебаний (ведь свет также частный случай электромагнитной волны). Про такие изменения говорят, что излучение рассеивается. Существует два вида рассеяния – релеевское, или упругое, при котором фотон отскакивает от препятствия, как мячик, не меняя своей частоты, и рамановское (комбинационное), или неупругое, при котором фотон при соударении с молекулой меняет и её энергетическое состояние, и своё собственное. По тому, что произошло с излучением, можно узнать о строении молекулы в тот момент, когда с ней неупруго столкнулся свет. Физики быстро научились специальными спектрометрами разделять рамановские фотоны от релеевских, но беда в том, что такие неупругие столкновения происходят нечасто, на несколько порядков реже упругих, релеевских столкновений, в результате чего комбинационное рассеяние оказывается очень слабым и во многих случаях обладает настолько низкой интенсивностью, что его нельзя зарегистрировать.

Решение проблемы было найдено, когда в 1974 году выяснилось, что рамановские фотоны можно многократно усилить. Если объект, рассеивающий свет, находится вблизи наноструктурированной металлической поверхности, то интенсивность рассеяния возрастает в миллиарды раз. До конца причины этого эффекта не ясны, но считается, что здесь работают плазмоны – квазичастицы, представляющие собой осцилляции поверхностных электронов относительно положительно заряженных ядер металла, заключённого в наноструктуру. При совпадении собственной частоты плазмона и рамановского фотона возникает резонанс, который и позволяет сделать видимым почти невидимое. На основе такого усиления вскоре появилась и соответствующая спектроскопия – SERS.

Биологи быстро поняли, что с помощью SERS можно много узнать о работе биомакромолекул молекул, не разрушая клетку и её органеллы. Однако активные попытки использовать поверхностно-усиленную рамановскую спектроскопию, начавшиеся с середины 2000-х годов, до сих пор особых успехов не приносят. Одно из главных препятствий заключалось в самих усиливающих рассеяние наноповерхностях: они либо не дают резонанс на нужных частотах, либо оказываются токсичны для биологического материала, либо разрушаются, будучи помещены в физиологическую жидкость.

Исследователям из Московского государственного университета вместе с коллегами из Дании и Германии удалось решить проблему: они смогли увидеть рамановское рассеяние, производимое молекулами вышеупомянутого цитохрома С «вживую», то есть прямо в митохондриях, чего до сих пор никто не делал. Поиск решения длился несколько лет: по словам Надежды Браже, первого соавтора статьи в Scientific Reports, чтобы создать подходящую наноструктуру и разработать новые методические приёмы для работы с ней и с митохондриями, понадобились объединённые усилия биологов, физиков и химиков, специалистов в нанохимии и материаловедении. В результате получилась сложноструктурированная серебряная поверхность, на которой разбавленную суспензию митохондрий облучали слабым лазерным пучком, а далее анализировали полученные спектры SERS. Оказалось, что при такой постановке эксперимента происходило многократное усиление комбинационного рассеяния только от молекул цитохрома С, благодаря чему можно было детально исследовать изменения, происходящие в его структуре при переносе электронов и синтезе АТФ. Поток электронов и синтез АТФ в митохондриальных мембранах то запускали, то останавливали, и изменения, происходившие при этом с молекулами белка, были хорошо видны в регистрируемых спектрах.

В данном случае важны даже не столько конкретные данные по работе митохондрий, сколько сам метод, который, надо думать, получит большое распространение: ведь теперь мы можем использовать такую спектроскопию, не разрушая материал, и потому нас ждёт больше важных деталей, касающихся молекулярной кухни клетки. Сами авторы работы планируют заняться исследованием митохондрий, выделенных из сердечных и скелетных мышц у крыс при заболеваниях сердечно-сосудистой системы и сахарном диабете. Известно, что неполадки, возникающие в митохондриях, могут быть причиной самых разных заболеваний, и сами они, постоянно работая с кислородом, служат источником агрессивных радикалов-окислителей, которые нужно всё время держать под контролем, чтобы не дать развиться окислительному стрессу – так что о практическом значении нового метода можно и не говорить.