С помощью естественного отбора удалось получить новый белок, исправляющий одни генетические буквы в ДНК на другие.

Среди методов редактирования генома сейчас самый популярный – метод CRISPR/Cas, о котором мы неоднократно рассказывали. Вкратце суть его такова: в клетку запускается особый белок (Cas), который режет ДНК там, где необходимо внести какие-то изменения – например, устранить мутацию. Белок ищет правильный адрес с помощью молекулы РНК, которую синтезируют специально для эксперимента и которую он держит при себе. Молекула РНК находит в клеточной ДНК нужную последовательность, после чего белок, как мы только что сказали, режет здесь обе нити ДНК. Разрыв привлекает клеточные ремонтные машины, которые стараются исправить повреждение. Исправляя, он заменяют поврежденный кусок ДНК на новый, но для этого нужен какой-то шаблон, по которому можно сделать «заплатку». Таким шаблоном может быть парная хромосома, на которой нет мутации, или опять же специально синтезированная небольшая ДНК, которую мы запускаем в клетку вместе со всей CRISPR-машинерией.

В молекуле ДНК генетические буквы в обеих цепях стоят строго напротив своих напарников: аденин напротив тимина, гуанин напротив цитозина. (Фото: danielleherrera / Flickr.com.)

Структура белка Cas из противовирусной системы CRISPR/Cas, который режет ДНК для редактирующего ремонта; оранжевым обозначена ДНК, с которой связался редактирующий фермент. (Фото: Wikipedia.)

Метод удобен тем, что редактирующий аппарат можно легко направить на любую последовательность – сделать нужную молекулу РНК с адресом очень легко. Однако есть вероятность, что в ДНК появятся непредусмотренные изменения, и появятся именно из-за разрезания/ремонта. Поэтому биотехнологи модифицировали режущий белок в CRISPR/Cas так, чтобы он не резал обе нити ДНК, а просто садился на нужное место. А вместе с ним сюда приходит другой белок, который прямо в ДНК превращает одну генетическую букву в другую.

Как мы знаем, ДНК (и РНК) представляют собой длиннейшие последовательности четырех азотистых оснований – сложных молекул, которые вполне можно называть генетическими буквами (основания прикреплены с сахаро-фосфатной основе, но нам сейчас это не важно). Нуклеотиды обозначаются буквами А (аденин), Т (тимин), Г (гуанин) и Ц (цитозин), и в двух цепях ДНК напротив Г всегда будет стоять Ц, а напротив А – Т. Если мы поменяем Ц на Т, то в молекуле ДНК возникнет напряженность, поскольку напротив новоявленного Т будет стоять не его законная пара – аденин, а оставшийся гуанин. И в таком случае клетка старается исправить последовательность, восстановить правильное спаривание.

Белок, который превращает одну букву в другую и который мы вносим в клетку вместе с системой CRISPR/Cas, называется цитидин дезаминаза. Детально о ней говорить мы не будем, скажем лишь, что с ее помощью можно точечно изменить букву С на букву Т. Здесь, повторим, не нужно рвать обе цепи ДНК, а потом по шаблону делать большую «заплатку» на поврежденное место. Просто пара цитозин–гуанин меняется на пару тимин–аденин, поэтому посторонних ошибок в окрестностях редактируемого адреса тут не случается. Но исправление С на Т – лишь одно из теоретически возможных. Однако так вышло, что сделать другое изменение, превратить букву А в букву Г, до сих пор было нельзя, соответствующего фермента не существовало в природе.

Николь Гауделли (Nicole M. Gaudelli) и ее коллегам из Гарварда удалось получить такой фермент, и замечательно то, что получали они его с помощью эволюции. У кишечной палочки есть белок, который превращает аденин в инозин – это еще одно азотистое основание, которое очень похоже на гуанин. Однако бактериальный фермент работает только с РНК, и заставить его работать с ДНК пока никому не удавалось.

Тогда исследователи пошли на хитрость. Они снабдили бактерий мутантным геном устойчивости к антибиотику хлорамфениколу: чтобы ген устойчивости начал работать, в нем было заменить А на инозин. Кишечную палочку заставляли расти в питательной среде с антибиотиком и ждали, когда в тот белок, который меняет аденин на инозин в РНК, попадет мутация, которая позволила бы ему сделать то же самое в ДНК – с таким мутантным белком бактерии могли бы выжить в присутствии антибиотика.

В итоге под давлением отбора нужный белок у бактерий появился, и его даже удалось тем же путем усовершенствовать – так, чтобы он менял нуклеотиды в любом контексте (то есть вне зависимости от того, какие у него рядом соседи), и чтобы он был достаточно эффективен. Можно сказать, эволюция, которая у бактерий идет намного быстрее, сделала для биологов бо́льшую часть работы.

Новый фермент работает не только в бактериальных, но и в человеческих клетках, причем никаких посторонних исправлений в редактируемом фрагменте ДНК не появляется. То, что он превращает аденин не в сам гуанин, а в близкий нуклеотид инозин, на самом деле не страшно – другие клеточные машины, обнаружив инозин в ДНК, сделают в этом месте гуанин. В статье в Nature говорится, что полученный в результате лабораторной эволюции белок сумел исправить в клеточной культуре настоящую вредную мутацию, из-за которой возникает наследственный гемохроматоз – болезнь, связанная с нарушениями в усвоении железа организмом. Эффективность замены составляет пока что 30%, но в перспективе авторы работы надеются ее повысить. Очевидно, с помощью «эволюционного» метода можно получить редактирующие ферменты и для обратных замен (чтобы превращать гуанин в цитозин, а аденин в тимин), и тогда мы станем еще на несколько шагов ближе к созданию точной и универсальной генной терапии.

По материалам The Scientist.