Собственные мутации в подопытных мышах приняли за побочный результат эксперимента.

Метод редактирования – это метод CRISPR (или CRISPR/Cas), о котором, пожалуй, слышали даже те, кто не слишком интересуется новейшими биотехнологиями.В основе CRISPR – система противовирусной защиты бактерий, которые умеют распознавать вирусную ДНК, когда она появляется в бактериальной клетке.

Оказалось, что молекулярные машины, которые обеспечивают бактериям защиту от вирусов, могут работать и в клетках животных, и что машины эти можно направить абсолютно на любой участок ДНК, чтобы там что-нибудь исправить. За последнее время появилось великое множество разновидностей метода CRISPR, и в научных журналах с завидной регулярностью появляются статьи о том, как биотехнологи с его помощью что-то у кого-то отредактировали.

Много шума наделала двухлетней давности статья китайских исследователей, которые с помощью CRISPR подправили геном человеческого эмбриона, и все больше появляется работ, авторы которых описывают, как им удалось исправить тот или иной мутантный ген либо в культуре клеток, либо в зародыше животного.

Плюсы CRISPR в его скорости – он работает быстрее других подобных методов, универсальности – в том смысле, что с его помощью можно изменять любую генетическую последовательность, и точности – он исправляет ДНК (или РНК) только там, где ему укажут.

Однако точность CRISPR все равно не стопроцентная, то есть для редактирующей машины некоторые участки в геноме кажутся настолько похожими, что она помимо того, что нужно, может отредактировать и то, что не нужно. Чтобы такого не происходило, есть специальные программы, которые рассчитывают, куда еще может направиться система CRISPR – зная, какие участки в геноме для нее особо привлекательны, можно постараться заранее сделать так, чтобы редактирующие ферменты туда все-таки не шли.

Но в прошлом году в Nature Methods появилась статья, авторы которой утверждали, что даже со специальными алгоритмами не всегда удается предсказать, куда вмешается система CRISPR. Об этой работе мы писали; суть там была в том, что в геноме мышей после CRISPR нашли более полутора тысяч мутаций, связанных с изменениями одного нуклеотида (одной генетической «буквы»), и более ста мутаций, связанных с вставками и удалениями более крупных фрагментов ДНК.

По словам авторов работы, все предсказательные программы, которые используются сейчас для оценки точности CRISPR, прошли мимо лишних исправлений. Обнаружить же их удалось потому, что геном подопытных мышей читали полностью, а не только в зонах риска, где можно было ожидать от CRISPR самодеятельности. Сами животные никак от массы мутаций не страдали, то есть мутации либо попали в те участки ДНК, от которых мало что зависит в повседневной жизни, либо же тут сработали какие-то компенсирующие механизмы. Но если оценивать медицинские перспективы метода, то использовать его оказывается слишком рискованно: если он так щедро генерирует лишние мутации, есть вероятность, что он повредит в геноме что-то важное.

Однако сразу после выхода статьи в свет многие специалисты выразили недоверие к опубликованным в ней результатам. Напор критики оказался столь силен, что авторам пришлось перепроверить свои результаты. И вот сейчас, как пишет портал The Scientist исследователи выступили с работой над ошибками: в новой статье, выложенной на сайте bioRxiv, они пишут, что никаких лишних мутаций в их мышах на самом деле не было. Откуда же они взялись в первый раз?

Дело в том, что геном «отредактированных» мышей сравнивали с мышиным геномом из большой генетической базы данных, в которую стекаются все прочитанные геномы от самых разных организмов. Однако в ДНК, несмотря на ее исключительную устойчивость к мутациям, все равно возникают какие-то изменения в последовательности генетических «букв» и даже целых буквенных блоков, и далеко не все такие изменения успевают исправить специальные белковые машины, которые следят за стабильностью генома. И хотя в лабораториях используют мышей, которые генетически идентичны друг другу, в их ДНК все равно появляются какие-то вариации, пусть и не проявляющиеся во внешнем облике и физиологии.

Сравнить геном одной и той же мыши до и после редактирования было невозможно, поскольку CRISPR-систему в эксперименте запускали в мышиный зародыш на стадии зиготы, когда будущая мышь представляет собой одну-единственную клетку – собственно зиготу, образовавшуюся в результате слияния яйцеклетки и сперматозоида. Но в таком случае можно было сравнить геном отредактированных мышей с геномом их родителей – это все равно дало бы более достоверный результат, чем сравнение с некогда прочитанным геномом из базы данных.

Подобные «базовые» геномы бывают очень кстати, когда мы ищем мутацию, которая проявляется достаточно явно, которая, например, взывает болезнь или, наоборот, дает устойчивость к какому-то заболеванию. Но есть и обычная, рутинная, если можно так сказать, генетическая изменчивость, благодаря которой ДНК одного поколения отличается от другого поколения даже в генетически однородных линиях лабораторных животных – и как раз такую изменчивость приняли за побочный результат работы CRISPR-редактора.

Надо заметить, что с момента публикации статьи про ошибки CRISPR появился целый ряд других работ, в которых говорилось об обратном – что метод CRISPR все же довольно точен и никаких лишних мутаций не генерирует. С другой стороны, здесь нельзя не вспомнить другую прошлогоднюю статью в Nature Medicine (о которой мы также писали): авторы ее – среди которых есть и один из тех, кто придумал CRISPR – пришли к выводу, что этот метод пока что мало подходит для работы с человеческими генами, потому что гены наши оказались слишком разнообразными.

В нуклеотидной последовательности гена многие генетические буквы могут меняться без вреда для клетки. (Иллюстрация: ADDRicky / Depositphotos) 

Структура бактериального белка Cas из противовирусной системы CRISPR-Cas; оранжевым обозначена ДНК, с которой связался редактирующий фермент. (Фото: Wikipedia)