Научные открытия, удостоенные в этом году премии по химии, стали возможны благодаря эволюционному подходу к химии биомолекул.

Нынешнюю Нобелевскую премию по химии хочется назвать одной из самых биологических – потому что над всеми тремя лауреатами в буквальном смысле веет дух Дарвина. Фрэнсис Арнольд (Frances H. Arnold) из Калифорнийского технологического института получила половину премии за метод направленной эволюции ферментов; Джордж Смит (George P. Smith) из Миссурийского университета и Грегори Уинтер (Gregory P. Winter) из Кембриджа вместе разделили другую половину премии за метод фагового дисплея в отборе пептидов и антител – в обоих случаях речь идет об использовании в химии эволюционных механизмов. Мы привыкли думать, что эволюция касается только слонов, мышей, бактерий, пшеницы и т. д., однако одни из главных принципов эволюционного развития, изменчивость и отбор, вполне работают и на уровне биомолекул.

Слева направо: Фрэнсис Арнольд, Джордж Смит, Грегори Уинтер.

Метод искусственной эволюции ферментов: 1 – в ДНК фермента вносят случайные мутации и мутантную ДНК вводят в бактерии; 2 – бактерии нарабатывают молекулы ферментов с разными мутациями; 3 – анализ мутантных ферментов на эффективность; 4 – повторение цикла.

Метод фагового дисплея: в ДНК фага встраивают ген, и в результате в оболочке частицы фага появляются инородные белковые молекулы, закодированные во встроенном гене. За эти белки можно фаговые частицы можно выловить с помощью антител.

Как мы знаем, ферменты – это большие (иногда очень большие) белковые молекулы, выполняющие те или иные химические реакции, выполняющие очень быстро и очень эффективно. Мысль использовать ферменты для того, чтобы они создавали нам новые материалы и вещества, появилась в научном мире довольно давно. Однако белки работают только в условиях живого организма, то есть в водном растворе определенной температуры, определенной концентрацией солей, уровнем рН и т. д. Кроме того, все ферменты выполняют только свои реакции: они расщепляют, соединяют, превращают лишь те молекулы, на которых они специализируются. Допустим, мы хотим, чтобы какой-то фермент стал расщеплять некое вещество, с которым он раньше дела не имел; более того, желательно, чтобы реакция шла не в воде, а, к примеру, в органическом растворителе. Что для этого нужно сделать?

Для этого нужно изменить структуру фермента. Как и всякий белок, он представляет собой сложно скрученную цепь из аминокислот. Последовательность аминокислот определяет, чем и как занимается белковая молекула. Казалось бы, чего проще: свойства аминокислот давно известны, их взаимоотношения в полипептидной цепи тоже можно просчитать, значит, все дело лишь в том, чтобы в ферменте переставить или заменить некоторые аминокислоты другими. Однако это легче сказать, чем сделать. Ферменты состоят из сотен и тысяч аминокислот, и даже сейчас, с применением мощных вычислительных алгоритмов, не всегда можно точно сказать, как та или иная аминокислотная замена повлияет на пространственную структуру и функции белка.

Поэтому Фрэнсис Арнольд, изначально выучившаяся на аэрокосмического инженера-механика и впоследствии переключившаяся в начале 80-х годов на ферменты, решила в прямом смысле положиться на природу. Арнольд экспериментировала с ферментом субтилизином, который расщепляет молочный белок казеин – идея была заставить субтилизин работать не в воде, а в органическом растворителе диметилформамиде. В то время белки уже можно было выращивать в бактериях, нужно было только методами генетической инженерии снабдить бактерию геном требуемого белка. Арнольд и ее коллеги вносили в ген субтилизина случайные мутации и вводили мутантные гены в бактерию. Затем получившиеся белки проверяли в 35-процентном растворе диметилформамида. Из мутантных белков кто-то работал в диметилформамиде лучше, кто-то хуже, и для следующего этапа отбирали тех, кто работал лучше – в них вносили новую порцию мутаций, и все повторялось.

По сути, все происходило так же, как и при обычной эволюции: в группе мышей появляются случайные мутации, которые в некоторых случаях помогают мышам выживать при тех или иных условиях, и когда эти самые условия наступают, преимущество в популяции получают конкретные особи. Только в случае с ферментом условия задавал экспериментатор, он же вносил изменения в белок и он же обирал наиболее удачные варианты.

Спустя три «поколения» субтилизинов исследователи получили вариант фермента, который работал в диметилформамиде в 256 раз эффективнее, чем исходный белок. В этом сверхэффективном субтилизине оказалось десять мутаций, которые должны были оказаться в нем именно все вместе – поодиночке у мутаций ничего бы не вышло.

Таков был первый шаг; второй сделал голландский исследователь Виллем Штеммер (Willem P. C. Stemmer), который тоже мог бы получить свою часть премии, если бы не умер в 2013 году. Он ввел в искусственную эволюцию ферментов еще один природный процесс – перетасовку фрагментов ДНК между генами. У нас такая перетасовка происходит при формировании половых клеток: разные варианты одного и того же гена, обмениваясь собственными фрагментами, получают друг от друга те или иные мутации, таким образом повышается изменчивость белков, и среди них появляются такие, которые объединяют в себе разу несколько мутационных «плюсов». Штеммер организовал то же самое при отборе ферментов: в пробирке плавало множество кусков ДНК, относящихся к одному и тому же белку, и эти куски с помощью специальных ферментов постоянно соединялись друг с другом. Затем получившиеся химерные гены отправляли в бактерии и потом сравнивали варианты готовых белков.

По мере развития методов генетической инженерии совершенствовалась и лабораторная эволюция ферментов. Фрэнсис Арнольд продолжала работать в этой области, и сейчас на счету ее лаборатории уже масса белков, выполняющих самые разные химические реакции, которые не встречаются в природе, но без которых не может обойтись, например, фармацевтическая промышленность и другие (био)химические отрасли.

История второй половины премии – за фаговый дисплей – тоже берет начало в первой половине 80-х годов. В то время о белках знали больше, чем о генах; на руках у исследователей было много известных белковых молекул, но никто не знал, в каком месте генома они закодированы. Джордж Смит предложил использовать для поиска генов бактериальных вирусов, или бактериофагов (или просто фагов). Фаги, как и любые другие вирусы, проникают в клетку и заставляют ее копировать собственный фаговый геном и синтезировать фаговые белки. Идея Смита состояла в том, чтобы в ДНК вируса вставить неизвестную ДНК (на тот момент на руках у исследователей были целые библиотеки ДНК из разных геномов, только никто не знал, что в них закодировано).

В результате в фаговой ДНК наш белок будет закодирован рядом с фаговым белком – лучше всего рядом с тем, который образует белковую оболочку вируса (капсид). И когда вирусная частица соберется, в оболочке вируса будет торчать и наш белок. Так можно получить целый набор вирусных частиц с самыми разными инородными белками. Притом мы помним, что исходно мы ищем ДНК к известному белку. На фаговых частицах будет сидеть множество различных белков, синтезированных на разных фрагментах из нерасшифрованной библиотеки. Как мы можем поймать вирусные частицы, в которые попала ДНК именно с нашим известным белком? С помощью антител. За антитела к белку мы вытащим из фагового супа те частицы, в которых есть наш белок и его ДНК, затем прочитаем геном фага с той вставкой, которую мы сами в него вставили – и так узнаем нужный ген.

Так появился метод фагового дисплея. Про него скоро стало ясно, что у него есть и масса других приложений, кроме как поиск соответствий между белками и генами. Грегори Уинтер, наш третий лауреат, приспособил этот метод для отбора антител. Иммунитет, как известно, производит огромное количество антител-иммуноглобулинов – огромное как в смысле количества, так и в смысле разнообразия. В его ассортименте всегда найдется антитело, которое сможет связаться с какой-нибудь доселе неизвестной бактериальной или вирусной молекулой и сообщить организму об опасности. Медики и биотехнологи давно хотели использовать иммуноглобулины ввиду их замечательных способностей очень специфично и очень крепко связывать только конкретные молекулы и не обращать внимания ни на какие другие. Изначально антитела для исследовательских нужд получали, вводя лабораторным мышам определенные молекулы (например, белки раковых клеток), и организм животных нарабатывал нужные иммуноглобулины. Но таким способом можно было далеко не всегда получить антитела в требуемых количествах; кроме того, мышиные белки, если их вводили людям, возмущали человеческий иммунитет.

Уинтер ввел в геном фага кусок ДНК, кодирующей человеческий иммуноглобулин – причем тот кусок, который кодирует «хватательную» часть белка (то есть ту, которая непосредственно распознает другую молекулу). Это была идея из фагового дисплея – ввести в вирус нужный белок. Только теперь на поверхности вируса сидел фрагмент антитела. Такой вирус можно было выловить из множества других как раз с помощью той молекулы, с которой должно было связываться антитело. Но среди иммуноглобулинов есть более эффективные и менее эффективные – те, которые взаимодействуют со «своей» молекулой более прочно и более специфично, и те, которые взаимодействуют с ней хуже. И тут в дело снова вступают эволюционные методы: Уинтер и его коллеги встраивали в фаговую ДНК множество разных вариантов ДНК антител. Все варианты были против одной и той же молекулы, но у всех неизбежно была разная эффективность. Затем начинался отбор: фагов вылавливали, анализировали, какие варианты ДНК кодируют наиболее эффективные антитела, и затем в эти варианты вносили новые мутации. Процедура повторялась, и на следующем этапе отбирали тех мутантов, которые оказались еще более эффективными. Причем все это было человеческие белки – ведь в фаг вставляли фрагмент человеческого гена.

Отбор антител с помощью фагового дисплея быстро нашел применение в фармацевтической промышленности. Сам Уинтер с коллегами сделал в 90-е годы человеческие антитела, которые успешно подавляли аутоиммунные процессы; препарат на основе этих антител начали использовать для лечения псориаза и ревматоидного артрита. И, естественно, потом дело дошло до иммуноглобулинов, которые очень специфично взаимодействуют с белками раковых клеток. (Точнее, речь идет об облегченных версиях иммуноглобулинов – такие «фагово-дисплейные» белки представляют собой только рабочую, распознающую часть антитела.)

Перечислять всевозможные приложения белков, отбираемых с помощью фагового дисплея, можно долго – как и в случае с ферментами, которые получают путем отбора в пробирке. И практическое, и теоретическое значение нобелевских открытий не вызывает сомнений. Однако нам кажется важным еще раз подчеркнуть, что оба открытия случились как результат глубокого понимания эволюционной теории – которая, как мы видим помогает не просто отвлеченно осмыслять мир вокруг, но и приносит непосредственные практические плоды.

По материалам Нобелевского комитета.